تشخیص مولکولی لیشمانیوز در سگ با استفاده از نمونه‌های سواب چشمی و بافی کوت خون

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

1 دانش‌آموخته کارشناسی ارشد انگل‌شناسی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

2 استاد بخش انگل‌شناسی، گروه پاتوبیولوژی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

3 دانشیار گروه علوم درمانگاهی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.

چکیده

   روش‌های مولکولی زیادی جهت تشخیص لیشمانیوز در سگ‌ها مورد استفاده قرار گرفته است. در این موارد بیشتر با روش‌های تهاجمی از بافت‌ها نمونه‌برداری می‌شود. هدف از این مطالعه ارزیابی استفاده از دو روش نمونه‌برداری غیرتهاجمی برای تشخیص لیشمانیوز در آزمایش PCRمی‌باشد. بدین منظور، تعداد60 قلاده سگ انتخاب شده و به‌طور مساوی به سه گروه: سگ‌های خانگی واجد جراحات جلدی (گروه اول)، سگ‌های خانگی فاقد جراحات جلدی (گروه دوم) و سگ‌های ‌ولگرد (گروه سوم) تقسیم شدند. پس از معاینه بالینی نمونه‌های سواب چشمی و بافی­کوت خون از هر سگ تهیه گردید. علاوه بر این در گروه اول گسترش نسجی نیز از ضایعات جلدی تهیه شد. ابتدا  DNAنمونه‌های سواب چشمی و بافی­کوت استخراج شده و جهت تعیین گونه‌های لیشمانیا با روش‌هایPCR وSeminested-PCR مورد آزمایش قرار گرفتند. سه نمونه مثبت جهت تأیید تشخیص نیز تعیین توالی گردیدند. گسترش‌های خونی نیز با گیمسا رنگ‌آمیزی شده و به‌صورت میکروسکوپی مورد آزمایش قرار گرفتند. از مجموع 60 سگ مورد آزمایش، در چهار نمونه  DNAسواب چشمی مربوط به گروه 3 و یک نمونهDNA  سواب چشمی و بافی­کوت مربوط به گروه اول آلودگی به لیشمانیا اینفانتوم تعیین گردید. همچنین در نمونه اخیر، اجسام لیشمن در گسترش رنگ‌آمیزی شده مشاهده گردید. بر اساس نتایج مولکولی و تعیین توالی  به‌دست آمده نتیجه‌گیری شد که لیشمانیا اینفانتوم در بین سگ‌های مشهد شایع بوده و هم‌چنین نمونه‌های  سواب چشمی می‌تواند به عنوان یک روش نمونه‌برداری غیرتهاجمی مناسب برای آزمایش ملکولی تشخیص لیشمانیا در سگ مورد استفاده قرار گیرد. 

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Molecular detection of canine Leishmaniasis using conjunctival swab and buffy coat samples

نویسندگان [English]

  • mohammadreza ariannejad 1
  • gholamreza razmi 2
  • javad khoshnegah 3
چکیده [English]

   Many molecular methods have been used for diagnose is of canine leishmaniasis. These methods mainly rely on tissue specimens provided by invasive approaches for molecular detection of leishmaniasis. The aim of this study was to evaluate two noninvasive sampling methods detection of Leishmaniasis using PCR method. For this purpose, a total of 60 dogs were selected and equally divided into three groups: pet dogs with cutaneous lesions (Group 1); pet dogs without cutaneous lesions (Group 2) and stray dogs (Group 3). After physical examination of dogs, eye swab and buffy coat samples were collected from each dog, also, tissue smears were prepared from the lesions of dogs in group 1. DNA of eye swab and buffy coat samples were extracted and used to detection of Leishmania species using PCR and semi-nested PCR tests. Blood smears were stained by Giemsa method for microscopic evaluation. Out of 60 dog, the DNA of four swab samples related to the dogs of Group3 and one swab and DNA of buffy coat sample in a dog in group 1 was infected with Leishmania infantum. Leishman bodies was only observed in tissue smear of one dog in group 1. Three positive samples were sequenced for confirmation of results. Based on the results of this study, Leishmania infantum infection is common among dogs in Mashhad area and it seems that ocular swab specimens can be used as a noninvasive method for molecular detection of leishmania infection in dogs.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Leishmania
  • Eye swab
  • Buffy coat
  • Molecular methods
  • Dog

مقدمه

   لیشمانیا به­عنوان تک­یاخته نسجی از اهمیت بهداشتی بالایی در پزشکی و دامپزشکی برخوردار است. این انگل به­وسیله پشه­های خاکی فلبوتومینه از جنس­های فلبوتوموس و لوتزمیا (به ترتیب در دنیای قدیم و دنیای جدید) به میزبان­های حساس منتقل می شود (Baneth et al., 2005). تاکنون در حدود 30 گونه لیشمانیا شناسایی شده که 20 گونه آن در انسان بیماری‌زا هستند و سبب بروز لیشمانیازیس جلدی و احشایی می‌گردند (2007 Dantas-Torres). بر اساس گزارش  سازمان بهداشت جهانی سالانه بیش از دویست میلیون از جمعیت جهان در معرض ابتلا به بیماری هستند (Baneth et al., 2005). سگ­ها مخزن اصلی لیشمانیا اینفانتوم عامل لیشمانیازیس احشایی بوده  و یکی از عوامل مهم چرخه انتقال بیماری به انسان محسوب می­گردند (Dantas-Torres, 2007; Baneth et al., 2005). بر اساس مطالعات انجام­شده لیشمانیازیس احشایی  ناشی از لیشمانیا اینفانتوم به­صورت گسترده در حوزه مدیترانه و خاورمیانه وجود دارد (Baneth et al., 2005).

   علائم بالینی لیشمانیازیس احشایی در سگ، از فرم بدون نشانه همراه با آلودگی محدود تا فرم کشنده متغیر بوده و بسته به حدت انگل و استعداد ژنتیکی میزبان متفاوت است. دوره نهفته بیماری از چند ماه تا چندین سال طول می­کشد (Baneth et al., 2005). مطالعات سرو­اپیدمیولوژیک نشان داده است که تعداد زیادی از سگ­های فاقد نشانه بالینی از نظر سرمی مثبت هستند (Moshfe et al., 2009). برای پیشگیری از لیشمانیازیس احشایی انسان، تشخیص سریع و دقیق سگ­های آلوده ضروری است. برنامه­های کنترل به دلایلی همچون آلودگی  بالای سگ­ها در مناطق اندمیک، عدم حساسیت آزمایشات تشخیصی برای شناسایی آنها و تأخیر زمانی بین تشخیص و حذف سگ‌های آلوده ممکن است فاقد کارآیی لازم باشند (Solano-Gallego et al., 2009). در سال­های گذشته روش­های استاندارد برای تشخیص انگل شامل روش­های میکروسکوپی، کشت آسپیره طحال،  عقده­های لنفاوی و مغز استخوان بود که در مجموع از حساسیت متغیر و نسبتاً پایینی برخوردار هستند (Solano-Gallego et al., 2009). آزمایشات سرولوژیکی در شناسایی موارد بالینی سگ­های آلوده واجد اهمیت هستند، اما در نمونه­های تحت­بالینی ممکن است حساسیت پایین‌تری نشان دهند (Lombardo et al., 2012). در مواردی نیز این آزمایشات به­دلیل ارائه عیار ناقص آنتی­بادی یا واکنش متقاطع بی­نتیجه مانده­اند. امروزه روش­های PCR با استفاده از DNA لیشمانیا به‌علت حساسیت و ویژگی بالا به­عنوان روشی فراگیر برای تشخیص لیشمانیازیس احشایی در فرم بالینی و تحت­بالینی  کاربرد دارند  (de Almeida Ferreira et al., 2012). تاکنون نمونه‌های مختلف بافتی از سگ شامل: آسپیره مغز استخوان، طحال، عقده­های لنفاوی، خون، ادرار، سواب ملتحمه و بیوپسی چشم با روش PCR، مورد استفاده قرارگرفته‌اند (Maia et al., 2009; Manna et al., 2004). در این میان خون و مغز استخوان معمولاً رایج­ترین بافت­های مورد استفاده هستند  (Baneth et al., 2005). اکثر این نمونه‌ها با روش تهاجمی تهیه شده که در سگ با درد همراه می‌باشد، اما نمونه­برداری غیرتهاجمی در سگ ساده‌تر بوده و بدون درد انجام شده و توسط صاحب سگ آسان­تر مورد پذیرش قرار می‌گیرد. تحقیقات نشان داده است که  به‌علت  وجود لیشمانیا در ملتحمه چشم سگ‌های بیمار، نمونه‌های به‌دست آمده از ملتحمه چشم منبع خوبی برای استخراج DNA لیشمانیا هستند (de Almeida Ferreira et al., 2008; de Almeida Ferreira et al., 2012).  لیشمانیا می‌تواند توسط گردش خون به این نقطه رسیده باشد یا اینکه در مناطق بومی به‌علت تراکم بالای  ناقلین و گزش مستقیم اطراف چشم سگ، وارد آن شده باشد (de Almeida Ferreira et al., 2008). همچنین نمونه بافی­کوت خون نیز به­خوبی در آزمایشات مولکولی تشخیص لیشمانیوز مورد استفاده  قرار گرفته است (Lachaud et al., 2002). در یک مطالعه، نمونه بافی­کوت خون و نمونه سواب ملتحمه چشم حساسیت و ویژگی بالایی در تعیین عامل لیشمانیازیس در سگ با روش PCR از خود نشان داده‌اند (de Almeida Ferreira et al., 2012). با توجه به اهمیت تشخیص  لیشمانیوز احشایی در سگ، هدف این مطالعه بررسی کارآیی استفاده از روش نمونه‌برداری از ملتحمه چشم و مقایسه با نمونه  بافی­کوت از خون  برای تشخیص مولکولی لیشمانیا، در سگ‌های شهرستان مشهد می‌باشد.

 

مواد و روش­ها

نمونه برداری

   مطالعه‌ حاضر در بازه‌ زمانی آذر ماه 1391 تا تیر ماه 1392 در دانشکده دامپزشکی دانشگاه فردوسی مشهد، آزمایشگاه بخش انگل­شناسی انجام گرفت. در این مدت، تعداد 60 قلاده سگ (به تفکیک تعداد 33 قلاده سگ نر و 27 قلاده سگ ماده)، که در محدود سنی 3 ماه تا 12 ساله و شامل نژادهای ژرمن شفرد 13قلاده، دوبرمن 5 قلاده، تریر 12 قلاده و نژاد مخلوط 30 قلاده بودند، توسط متخصص بیماری­های داخلی دام­های کوچک معاینه شده و بر اساس وجود و یا عدم وجود علائم بالینی به‌طور مساوی مطابق مشخصات در سه گروه: سگ‌های صاحب‌دار دارای نشانه بالینی، سگ‌های صاحب‌دار فاقد نشانه بالینی و سگ‌های ولگرد  قرار گرفتند. سگ­های خانگی با رضایت صاحب حیوان در گروه­های مطالعاتی قرار گرفتند و طی مدت مطالعه تمام اصول اخلاقی در ارتباط با حیوان رعایت گردید.

خون‌گیری از شریان سفالیک انجام شد و نمونه خون هر سگ به میزان 5 میلی­لیتر به­طور جداگانه در لوله‌های حاوی ماده ضد انعقاد EDTA جمع­آوری ‌گردید. همزمان توسط سواب پنبه‌ای استریل تراشه‌های سلول‌های اپی‌تلیال ملتحمه چشم راست و چپ سگ به‌طور جداگانه برداشت شد. همچنین از سگ‌های واجد ضایعات جلدی گسترش نسجی تهیه گردید. نمونه‌های خون به لوله‌های هماتوکریت منتقل شده و پس از سانتریفیوژ با دور 15000 به مدت 5 دقیقه  بافی­کوت تشکیل شده در این لوله‌ها  برداشت شده و در میکروتیوب جمع‌آوری شدند (شکل 1). نمونه‌های بافی­کوت و سواپ چشمی  در دمای 20- درجه سلسیوس تا زمان انجام آزمایش  PCRنگه­داری شدند.


 

 

 

 

 

شکل 1- روش نمونه‌برداری از چشم سگ با استفاده از سواب

 


آزمایش انگل شناسی

   در آزمایشگاه انگل‌شناسی، ابتدا گسترش‌های نسجی با متانول تثبیت و با رنگ گیمسای 5 درصد به مدت 30 دقیقه رنگ‌آمیزی گردیدند، سپس با استفاده از میکروسکوپ نوری و عدسی شیئی ×40 و ×100 اقدام به جستجوی اجسام لیشمن شد.

استخراجDNA و آزمایش PCR

DNA    بافی‌کوت و سواب چشمی توسط کیت تجاری MBST مطابق دستورالعمل شرکت سازنده استخراج شد(DNA Extraction Kit تهیه شده در مرکز رشد زیست فناوری پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک - تهران). به منظور بررسی کیفیت DNA استخراج شده، مقداری از آن روی ژل آگاروز یک درصد الکتروفورز ‌گردید. پس از پایان عملیات استخراج، نمونه­های DNA تا زمان انجام آزمایش در فریزر 20- درجه سلسیوس نگه­داری شدند.

   آزمایش PCR  جهت تشخیص گونه‌های لیشمانیا در دو مرحله انجام گرفت. در مرحله اول برای تعیین جنس لیشمانیا، نمونه‌های  DNAاستخراج شده از بافی­کوت و نمونه های چشمی با متد لاچاد و همکاران با استفاده از پرایمرهای RV1 و RV2 مورد آزمایش قرار گرفتند (Lachaud et al., 2002). نمونه­های مثبت واجد باند قابل رویت bp 145 می­باشند. در مرحله دوم نمونه­های مثبت در آزمایش اولیه، جهت تشخیص مولکولی گونه‌های لیشمانیا اینفانتوم، لیشمانیا تروپیکا و لیشمانیا ماژور با متد آرانسای و همکاران  و با استفاده از پرایمرهای LINR4، LIN17 و LIN19 مورد آزمایش Semi-nested PCR قرار گرفتند (Aransay et al., 2002). برای انجام هر واکنش PCR  از  مسترمیکس  PCR (ساخت شرکت بیونیر- کره جنوبی) و از نمونه‌های کنترل منفی و مثبت  استفاده شد.  باند حاصل برای لیشمانیا اینفانتوم 720 جفت باز، برای لیشمانیا تروپیکا 760 جفت باز و برای لیشمانیا ماژور 650 جفت باز می‌باشد.

تعیین توالی

   محصول PCR سه نمونه‌ مثبت  جهت تعیین توالی به شرکت بیونیر کره جنوبی ارسال شدند. پس از تعیین خوانش نمونه­های ارسالی، ترادف نوکلئوتیدی نمونه­های ارسالی با استفاده از نرم­افزار Clc main work  با توالی شناخته شده نمونه‌های لیشمانیا  در بانک ژنی NCBI  مورد مقایسه قرار گرفتند.

 

یافته‌ها

   ضایعات جلدی در گروه اول سگ‌های خانگی مورد مطالعه (تعداد 20 قلاده)، بیشتر در اطراف بینی، پوزه، دهان، چشم و گوش قابل ‌مشاهده ‌بودند و در این گروه فقط در گسترش رنگ­آمیزی شده یک قلاده سگ، آماستیگوت­های لیشمانیا مشاهده ‌شد.  نتایج آزمایشPCR  مرحله اول نشان‌دهنده آلودگی هم­زمان یک نمونه بافی‌کوت خون و سواب چشمی در یک قلاده سگ از گروه اول (سگ‌های صاحب­دار واجد جراحات جلدی) بوده و 4 نمونه سواب چشمی در گروه سوم (سگ‌های ولگرد) بودند (شکل 2).

 

 

 

شکل 2- نتیجه الکتروفورز محصول PCR جهت شناسایی جنس لیشمانیا (نمونه‌ها روی ژل آگارز (2%) رنگ‌آمیزی شده با اتیدیوم بروماید). M: باند حاصل از Ladder 100، P: کنترل مثبت، N: کنترل منفی. در شماره­های 1،2،3،4،5 نمونه­های 3-1 مثبت می‌باشند و نمونه‌های 5-4 از نظر وجود لیشمانیا منفی هستند (باندهای bp 145 نشان‌دهنده وجود جنس لیشمانیا می‌باشد).

 

 

 

   در گروه سوم (سگ‌های صاحب­دار فاقد نشانه بالینی) هیچ نمونه مثبتی یافت نشد. آزمایش تشخیص گونه‌های  لیشمانیا با روش مولکولیSeminested PCR  روی نمونه‌های مثبت بافی­کوت و سواپ چشمی صورت گرفت که تمام نمونه‌ها، آلوده به لیشمانیا اینفانتوم بودند (شکل 3).

   نتایج مقایسه هم­ردیفی توالی‌های به­دست آمده با توالی‌های بانک ژنی نیز آلودگی به لیشمانیا اینفانتوم را در سه نمونه ارسالی تأیید کرد.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3- نتیجه الکتروفورز محصول Semi–nested PCR جهت شناسایی گونه­های لیشمانیا (نمونه‌ها روی ژل آگارز (2%) رنگ‌آمیزی شده با اتیدیوم بروماید).M :  باند حاصل از Ladder 100، P: کنترل مثبت، N: کنترل منفی. شماره‌های 1،2،3 نمونه‌های نشان‌دهنده وجود لیشمانیا اینفانتوم با باند bp720 می­باشند.

 


بحث و نتیجه­گیری

   در مطالعه حاضر فقط در گسترش‌های رنگ‌آمیزی شده یک قلاده سگ صاحب‌دار دارای ضایعات جلدی،  اجسام لیشمن دیده شد. نتایج آزمایش میکروسکوپی نشان داد این روش با وجود درجه ویژگی بالا از حساسیت پایین در تشخیص لیشمانیازیس سگ ‌به‌خصوص هنگامی که تعداد انگل در بافت کم است، برخوردار است (Srividya et al., 2007). به­همین دلیل، امروزه روش PCR به­علت حساسیت و ویژگی بالا بر اساس ردیابی DNA اختصاصی لیشمانیا در مطالعات زیادی به منظور تشخیص و تعیین هویت انگل لیشمانیا در بافت‌های مختلفی مورد استفاده قرار گرفته ‌است (Solano-Gallego et al., 2009; Srividya et al., 2012; Strauss et al., 2004).

   تهیه نمونه بافتی برای آزمایش  PCRدر سگ‌های زنده از اهمیت زیادی برخوردار است و به دلیل استفاده از روش‌های نمونه‌برداری تهاجمی، در اکثریت موارد این نمونه به سختی در سگ تهیه می­گردد. امروزه محققین سعی و تلاش در نمونه‌برداری از بافت‌ها به‌صورت غیرتهاجمی و بدون درد در سگ‌ها دارند تا نمونه‌برداری  آسان­تر مورد پذیرش صاحبان سگ قرار گیرد (Strauss et al., 2004). تحقیقات نشان داده است که  نمونه‌های به‌دست آمده از ملتحمه چشم منبع خوبی برای استخراج DNA لیشمانیا هستند و نتایج PCR به‌دست آمده روی این نمونه‌ها از حساسیت  و ویژگی بالایی در تشخیص لیشمانیازیس در سگ برخوردار بوده‌اند (Leite et al., 2011; de Almeida Ferreira et al., 2012; de Almeida Ferreira et al., 2008).

    نمونه سواب تهیه شده از ملتحمه چشم به‌طور موفقیت‌آمیزی در تشخیص لیشمانیوز احشایی در سگ‌های فاقد علائم نیز مورد استفاده قرار گرفته است (Leite et al., 2010) و حتی در مقایسه با سایر روش‌های نمونه‌برداری با روش تهاجمی نیز کارآمدتر بوده است (Lombardo et al., 2012). در مطالعه حاضر ارزیابی نتایج تشخیص مولکولی لیشمانیا روی نمونه‌های سواب ملتحمه چشم و بافی­کوت خون نشان داد که نمونه­های سواب چشمی (5 نمونه) در مقایسه با بافی­کوت خون (1 نمونه) در تشخیص لیشمانیازیس سگ با روش مولکولی کارآیی بیشتری دارند. در مطالعه‌ای مشابه در برزیل نیز نمونه‌های سواب چشم و بافی­کوت را برای تشخیص ملکولی لیشمانیازیس احشایی مورد آزمایش قرار دادند. برای این منظور دو گروه 23 تایی از سگ‌های سرم مثبت در نظر گرفته ‌شد و نمونه‌های سواب از ملتحمه هر دو چشم و بافی­کوت  جمع‌آوری شدند. پس از انجام آزمایش‌های مولکولی، میزان آلودگی در نمونه های سواب چشمی گروه یک و دو  به ترتیب  9/73 درصد و 2/52 درصد برآورد شد، در حالی­که این میزان آلودگی در نمونه‌های بافی­کوت این دو گروه به ترتیب  13 درصد و 4/30 درصد  بودند (de Almeida Ferreira et al., 2008). در مطالعه حاضر لیشمانیا اینفانتوم به­عنوان تنها گونه آلوده­کننده 20 درصد سگ‌های ولگرد و 5 درصد سگ‌های خانگی دارای نشانه بالینی، تشخیص داده شد. نتایج به‌دست آمده با سایر مطالعات اپیدمیولوژیک انجام شده در بین سگ‌های ایران (Mohebali et al., 2005; Mohebali et al., 2011; Haddadzade et al., 2013; Hosseininejad et al., 2012; Mostafavi et al., 2014) و شهرستان مشهد (Heidarpour et al., 2012; Sabzavari et al., 2013) هم‌خوانی دارد. در این مطالعه آلودگی سگ‌ها به لیشمانیا تروپیکا مشاهده نگردید. نتایج مولکولی و تعیین توالی نیز موید این نتیجه می‌باشد. تاکنون گزارشات اندکی از آلودگی سگ‌ها به لیشمانیا تروپیکا در ایران  گزارش شده است (Mohebali et al., 2011; Mohebali et al., 2005). بر اساس نتایج مطالعه حاضر لیشمانیا اینفانتوم به عنوان عامل اصلی لیشمانیازیس احشایی در سگ‌های شهرستان مشهد تعیین گردید و از طرفی  نمونه سواب چشمی به عنوان یک روش ساده و کاربردی می‌تواند در  تشخیص مولکولی لیشمانیازیس احشایی در سگ مورد استفاده قرار گیرد.  

    • Aransay, A., Scoulica,  E. and Tselenti, Y. (2000). Detection and Identification of Leishmania DNA within Naturally Infected sand flies by seminested PCR on minicircle kinetoplastic DNA. Applied and Environmental Microbiology, 66: 1933-1938.
    • Baneth, G., Day, M., Roura, X. and  Shaw, S. (2005). Leishmaniosis. In : Shaw, S. and Day, M. Arthropod-borne infectious diseases of the dog and cat . London: Manson Publishing Ltd., pp: 89-99.
    • Dantas-Torres, F. (2007). The role of dogs as reservoirs of Leishmania parasites, with  emphasis on Leishmania (Leishmania) infantum and Leishmania (Viannia) braziliensis. Veterinary  Parasitology, 149: 139-146.
    • de Almeida Ferreira, A., Ituassu, L.T., de Melo, M.N. and de Andrade, A.S. (2008). Evaluation of the conjunctival swab for canine visceral leishmaniasis diagnosis by PCR-hybridization in Minas Gerais State, Brazil. Veterinary Parasitology, 152(3-4): 257-263.
    • de Almeida Ferreira, S., Leite, R.S., Ituassu, L.T., Almeida, G.G., Souza, D.M., Fujiwara, R.T., et al. (2012). Canine skin and conjunctival swab samples for the detection and quantification of Leishmania infantum DNA in an endemic urban area  in Brazil. PLOS Neglected Tropical Diseases, 6(4): e1596.
    • Haddadzade, H.R., Fattahi, R., Mohebali, M., Akhoundi, B. and Ebrahimzade. E. (2013). Seroepidemiologcal Investigation of Visceral Leishmaniasis in Stray and Owned Dogs In Alborz Province, Central Iran UsingDirect Agglutination Test. Iranian Journal of  Parasitology, 8:152-157.
    • Heidarpour, M., Pourtaghi, M. and Khoshnegah, J. (2012). Prevalence and Risk Factors for Canine Leishmaniasis in Mashhad, North East of Iran. Iran Journal of Veterinary  Science and Technology, 4: 1-23.
    • Hosseininejad,  M., Mohebali, M., Hosseini, F., Karimi, S., Sharifzad, S. and  Akhoundi, B. (2012). Seroprevalence of canine visceral leishmaniasis in asymptomatic dogs in Iran. Iranian Journal of  Veterinary Research,  13: 54-47.
    • Lachaud, L., Marchergui-Hammami, S., Chabbert, E., Dereure, J., Dedet, J. and Bastien, P. (2002). Comparison of six methods using peripheral blood for detection of canine visceral leishmaniasis. Journal of  Clinical Microbiology, 40: 210-215.

      • Leite, R.S., Ferreira, Sde.A., Ituassu, L.T., de Melo, M.N. and de Andrade, A.S. (2010). PCR diagnosisof visceral leishmaniasis in asymptomatic dogs using conjunctival swab samples. Veterinary Parasitology, 170: 201-206.
      • Leite, R.S., Mendes, V.C., Ferreira, A.L. and Andrade, A.S. (2011). The use of conjunctival swab samples for PCR screening for visceral leishmaniasis in vaccinated dogs. The Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, 20: 36-41.
      • Lombardo, G., Pennisi, M.G., Lupo, T., Migliazzo, A., Caprì, A. and Solano-Gallego, L. (2012). Detection of Leishmania infantum DNA by real-time PCR in canine oral and conjunctival swabs and comparison with other diagnostic techniques. Veterinary Parasitology, 184: 10-17.
    • Maia, C., Ramada, J., Cristóvão, J.M., Gonçalves, L. and Campino, L. (2009). Diagnosis of canine leishmaniasis: conventional and molecular techniques using different tissues. Veterinary  Journal, 179: 142-144.
    • Manna, L., Vitale, F., Reale, S., Caracappa, S., Pavone, L.M., Morte, R.D., et al. (2004). Comparison of different tissue sampling for PCR-based diagnosis and follow-up of canine visceral leishmaniosis. Veterinary  Parasitology, 125: 251-262.
    • Mohebali, M.,  Hajjaran, H., Hamzavi, Y., Mobedi, I., Arshi, Sh., Zarei, Z., et al. (2005). Epidemiological aspects of canine visceral leishmaniosis in the Islamic Republic of Iran. Veterinary Parasitology, 129: 243-251.
    • Mohebali, M., Malmasi, A., Hajjaran, H., Jamshidi, S., Akhoundi, B., Rezaei, M., et al. (2011).  Disseminated Leishmaniasis Caused by Leishmania tropica  in a Puppy from Karaj, Central Iran. Iranaian  Journal of Parasitology, 2: 69-73.
    • Moshfe, A., Mohebali, M., Edrissian, Gh., Zarei, Z., Akhoundi, B., Kazemi, B., et al. (2009). Canine visceral leishmaniasis: Asymptomatic infected dogs as a source of L. infantum Infection. Acta Tropica, 112: 101-105.
    • Mostafavi, M.,  Akhtardanesh, B., Sharifi, I., Kakooei, S., Khedri, J. and Bamorovat, M. (2014). Seroprevalence of canine visceral leishmaniasis in southeast of Iran. Journal of Parasitic Diseases, 38: 218-222.
    • Sabzavari, S., Razmi, G.R., Naghibi, A. and Khoshnegah, J. (2013). A serological study of Leishmania infantum in dogs of Khorasan Razavi province, Iran. Journal of Parasitic Diseases, 37: 189-191.
    • Solano-Gallego,  L., Koutinas,  A., Miro,  G., Cardso,  L., Penisi,  M.G.,  Ferrer,  L., et al. (2009). Directions  for  the  diagnosis, clinical  staging, treatment  and  prevention  of  canine  leishmaniasis.  Veterniary  Parasitology, 165: 1-18.
    • Srividya, G., Kulshrestha, A., Singh, R. and  Salotra, P. (2012). Diagnosis of visceral leishmaniasis: developments over the last decade. Parasitology Research, 110: 1065-1078.
    • Strauss-Ayali, D., Jaffe, C.L., Burshtain, O., Gonen, L. and  Baneth, G. (2004). Polymerase chain reaction using noninvasively obtained samples, for the detection of Leishmania infantum DNA in dogs. The Journal of Infectious Diseases, 189: 1729-33.