ارزیابی خواص ضدباکتریائی عصاره الکلی بره‌موم بر جدایه‌های ورم پستان گاوی در شرایط آزمایشگاهی

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار گروه پاتوبیولوژی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.

2 دانشجوی دکترای دانشکده دامپزشکی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.

چکیده

   مطالعه حاضر با هدف بررسی تاثیر ضد باکتریائی عصاره بره­موم بر تعدادی از جدایه­های مربوط به ورم پستان گاوی انجام گردید. بدین منظورازروش انتشار درآگار جهت انجام آزمایش حساسیت میکروبی و از روش رقت لوله­ای جهت تعیین حداقل غلظت ممانعت از رشد (MIC) و حداقل غلظت باکتری­کشی (MBC) به­طور جدا­گانه استفاده گردید. آزمایش حساسیت میکروبی در مورد آنتی­بیوتیک­های استاندارد تتراسایکلین و آمیکاسین و نیز دیسک آغشته به عصاره الکلی بره­موم نشان داد که قطر منطقه عدم رشد ایجاد­شده توسط این ترکیب در مورد همه جدایه­های مورد آزمایش بزرگ­تر و در مورد اشریشیا کولی و کلبسیلا نومونیا این اختلاف اندازه معنی­داری (05/0p<) بود. همچنین نتایج حاصل از آزمایشات MIC وMBCهم مشخص کرد که میزان مهار رشد باکتری توسط بره­موم با میزان بره­موم موجود در رقت­ها رابطه مستقیم دارد و با افزایش میزان بره­موم در هر رقت از تعداد کلنی­های باکتری بعد از کشت کاسته­شده و در رقتی که نشان­دهنده MBCعصاره بره­موم در مورد هریک از جدایه­ها بود،هیچ­یک از آن­ها اصلاً رشد نکرد.لذا به نظر می­رسد که می­توان از ترکیبات مربوط به این ماده طبیعی به عنوان مواد آنتی­باکتریال مناسب به طور موثر ­علیه طیف وسیعی از باکتری­های ایجاد­کننده ورم پستان گاوی به­جای آنتی­بیوتیک­های صناعی استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

In vitro evaluation of antibacterial properties of propolis alcoholic extract on bovine mastitis isolates

نویسندگان [English]

  • younes anzabi 1
  • sohayb shaghaghi 2
چکیده [English]

   This study aimed to investigate the antibacterial effect of propolis alcoholic extract on the number of bovine mastitis isolates. For this purpose, agar disk diffusion method for determination of bacterial sensitivity and dilution method for determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) was used separately. The results of bacterial sensitivity test in the case of the standard antibiotics of tetracycline, amikacine and also disks impregnated with alcoholic extracts of propolis showed that the diameter of inhibition zone created by the mentioned combination about all of tested isolates was far larger and this difference about Escherichia coli and Klebsiella pneumonia isolates, was significant (p<0.05). Also the results of MIC and MBC tests indicated that the inhibition of bacterial growth by alcoholic extract of propolis had a direct relationship with the amount of available propolis in the dilution and increasing of propolis in each dilution, reduced the number of cultured bacterial colonies and no bacterial growth was observed in the dilution equivalent to MBC of propolis. Therefore, it seems that constitutes of this natural compound could be used as effective antibacterial agents against a wide range of bacteria causing bovine mastitis instead of using synthetic antibiotics.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Propolis
  • Alcoholic extracts
  • antibacterial effect
  • Isolates of mastitis

مقدمه

   بره­موم (Propolis)ماده­ای چسبنده و خمیری شکلی است که توسط زنبورهای عسل کارگر برای مصارف متعدد از جمله بستن منافذ داخل کندو و جلوگیری از اثر نور و رطوبت و مقابله با عوامل خارجی و نیز ضدعفونی و تنظیم دمای محیط داخلی کندو استفاده می­شود. این ماده چسبنده غیر­سمی بر اساس ویژگی‌های فیزیکی، شیمیایی و مکان جغرافیایی که این ماده از آنجا تهیه می­شود، به 12 نوع تقسیم می‌گردد.بره­موم حدوداً حاوی 30 درصد موم (wax)، 55 درصد رزین و بالزام (balsams)، 10 درصد روغن‌های اتری و اسید­های چرب و 5 درصد گرده گل­ها (pollen) می‌باشد (رضویان و همکاران 1391). در ارتباط با خواص فیتو­شیمیائی بره­موم زنبور­عسل با استفاده از روش­های آنالیز بیوشیمیائی بیش از 300  ترکیب مختلف شناسائی شده و مشخص کرده­اند که ماده مذکور، از ترکیبات متنوعی از جمله مقادیر بسیار بالایی از فلاونوئیدها، الکل­ها، اسیدهای آلفاتیک، آمینواسیدها، اسیدهای آروماتیک، استرهای آروماتیک، کالکون­ها، تریپنوئیدها، قندها و استروئیدها تشکیل شده­است (Marcucci, 1995؛مرادی،1388). همچنین مشخص شده که بره­موم حاوی مقادیر بالایی از ویتامین­ها به­خصوص ویتامین B­ کمپلکس، ویتامین C، ویتامینE  و پروویتامین A و مواد معدنی و عناصر کمیابی مانند کلسیم، منیزیم، آهن، روی، سیلیس، پتاسیم، فسفر، منگنز، کبالت و مس می‌باشد. (هاتفی و همکاران1387). البته بایستی توجه کرد که به­طور کلی خواص کیفی و رنگ بره­موم بستگی به منابع گیاهی دارد که توسط زنبور­های هر کندو مورد استفاده قرار می­گیرد (Isla, 2005؛ خادم حقیقیان و همکاران، 1390). همچنین نشان داده شده که ترکیبات فعال مهم موجود در بره­موم، شامل فلاوونوئیدها و اسیدهای فنولیک می‌باشند (Park et al., 2002; Almas et al., 2001; Chena et al; 2009;   ).

   از طرف دیگر از آنجایی که بره­موم دارای طیف وسیعی از فعالیت­های بیولوژیکی است، در طب سنتی هم به‌طور فراوان کاربرد دارد به‌طوری‌که عسل و بره موم قرن­هاست که در درمان زخم­ها استفاده می­شوند (خادم حقیقیان و همکاران 1390؛ 2001 etal., Banskota). هم‌چنین از این ماده در طب سنتی برای درمان بسیاری از بیماری­های سیستمیک مانند آرتریت روماتوئید، مشکلات پوستی مانند اگزما و لوپوس، مشکلات تنفسی مانند آسم و نیز بالا­بردن سلامت عمومی استفاده می­شود (رضویان و همکاران1391). در بررسی اتنوفارماکولوژی ماده مذکور در ایران نیز می‌توان به خواص درمانی این ترکیب نظیر معالجه سرفه، سرماخوردگی، دردهای قفسه سینه، سوختگی­ها، زخم­ها و مشکلات لثه ودندان به عنوان ضدعفونی­کننده و التیام­بخش اشاره کرد (سیدی و فرشینه، 1389). همچنین ویژگی­های درمانی بره­موم به عنوان ماده­ای با خواصی نظیر ضد­مسمومیت کبدی، ضدسرطان، آنتی‌اکسیدان، ضدالتهاب، ضدمیکروبی و ضدویروس و نیز افزایش­دهنده فعالیت­های ایمنی بدن گزارش گردیده است (رضویان و همکاران 1391؛ Tosi et al., 2007; Borrelli et al., 2007; Khalil et al., 2006).

   انواع اورام پستان در نشخوارکنندگان و مخصوصاً در گاو بدون شک از نظر اقتصادی حائز اهمیت بالائی در همه کشورها است و علی­رغم این­که در سال­های اخیر تحقیقات و اقدامات وسیعی جهت کنترل آن­ها صورت گرفته، ولی هنوز هم به­عنوان یک مشکل اصلی در خصوص بهداشت شیر و فراورده­های لبنی در بسیاری از نقاط دنیا مطرح می‌باشند. در این میان استافیلوکوکوس آرئوس و استرپتوکوکوس آگالاکتیه به عنوان مهم­ترین عوامل ایجاد­کننده ورم پستان واگیر­دار در گاو نقش مهمی در کاهش تولید شیر، افت کیفیت شیر و حذف اجباری و زود هنگام دام­ها از گله دارند. همچنین باکتری استرپتوکوکوس دیس‌گالاکتیه عامل مهمی در ایجاد ورم پستان حاد در گاو بوده و نحوه بیماری­زائی آن تقریبا مشابه باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه می­باشد،اما اشاعه به­مراتب کمتری داشته و معمولاً به صورت انفرادی دیده می­شود. از طرف دیگر ورم پستان محیطی یا تورم پستان کولی­فرمی در گاو که عوامل دخیل در آن عبارتند از: اشریشیا کولای، کلبسیلا نومونیا و انتروباکتر آئروژنز، اغلب به­صورت فوق حاد بروز می­کند و معمول‌ترین فرم کشنده ورم پستان، مخصوصاً در مورد آن دسته از گاوهای شیری است که در فصول سرد سال در فضای بسته نگه‌داری می­شوند­. البته وقوع این نوع ورم پستان غالباً با سطح بهداشت و آلودگی محیط با باکتری­های ذکر­شده ارتباط دارد. در دسترس­ترین روش مبارزه با انواع اورام پستان­ در گاو تشخیص دقیق و به­موقع عامل ایجاد­کننده و در ­نهایت اقدام به درمان با استفاده از آنتی­بیوتیک­های مناسب پس از بررسی میزان حساسیت و مقاومت جدایه­ها با انجام آزمایش سنجش حساسیت میکروبی می­باشد. اهمیت این امر زمانی بیشتر مشخص می­شود که توجه گردد که مقاومت آنتی‌بیوتیکی در میان باکتری­های ذکر شده هم رو به گسترش می­باشد (طباطبائی و فیروزی1380). 

   فعالیت ضدباکتریائی بره­موم در مورد برخی از باکتری­های بیماری­زا نظیر استرپتوکوکوسسیرکوئیتس،  استرپتوکوکوسپیوژنز،استرپتوکوکوس موتانس، استرپتوکوکوسسوربینوس، استافیلوکوکوسآرئوس و سالمونلاها، هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در شرایط بالینی، به­خوبی توصیف شده است. در واقع پژوهش­ها در این زمینه نشان داده که فعالیت چند­گانه بره­موم باعث می­شود که گلیکان سنتز­شده توسط باکتری­های مذکور نامحلول شده و در نتیجه فعالیت آنزیم گلیکوزیل ترانسفراز که آنزیم مؤثر در انتقال گلوکز و رشد و تکثیر باکتری­ها می­باشد، متوقف شود (Orsi et al., 2005; Velazquez et al., 2007; Seidel et al., 2008; Chena et al., 2009؛ رضویان و همکاران 1391). البته مکانیزم عمل ضد­باکتریایی بره­موم پیچیده بوده و ظاهراً به نظر می­رسد که شباهتی با عملکرد اکثر آنتی بوتیک­های کلاسیک ندارد، اما با توجه به اینکه بره­موم از تقسیم باکتری­ها ممانعت می‌کند، لذا می­توان به این نکته اشاره کرد که احتمالاً از این نظر مانند آنتی­بیوتیک نالیدیکسیک اسید عمل می‌کند چرا که آنتی بیوتیک مذکور­هم از همانند­سازی DNA و در ­نتیجه تقسیم سلولی ممانعت به­عمل می‌آورد. همچنین بعضی از محققین معتقدند که بره­موم می‌تواند مانع از فعالیت RNA پلی­مراز وابسته بهDNA  میکروارگانیسم­ها شده و همچنین فعالیت آنزیم­های محدود­الاثر آ­نها را مهار کند. از سوی دیگر معتقدند که بره­موم از سنتز پروتئین باکتری­ها هم ممانعت به عمل آورده و باعث ایجاد تغییر در ماهیت ساختمان غشای سیتوپلاسمی و دیواره سلولی شده و در نهایت باعث لیز نسبی باکتری­ها می­گردد. از طرف دیگر نشان داده­اند که بره­موم باعث تخریب باکتری اسپورزای عامل بیماری لوک آمریکائی زنبور عسل شده و نیز مانع از تشکیل مجدد اسپور و رشد آن در محیط کشت می­گردد که این یافته نشان­دهنده وجود موادی در بره­موم با تأثیر روی اسپور باکتری­ها و از بین بردن آن­ها در محیط­های زنده می­باشد (مرادی ، 1388).

با توجه به مطالب بالا و  نظر بر این­که بررسی مشخصی در خصوص تاثیر عصاره الکلی بره­موم بر باکتری­های ایجاد کننده ورم پستان گاوها در ایران انجام نگرفته است، لذا تحقیق حاضر با هدف بررسی میزان تاثیر ماده مذکور بر تعدادی از جدایه­های مربوط به اورام پستان­ گاوی و نیز احتمال جایگزینی موفقیت­آمیز این ماده به­جای آنتی بیوتیک­های مورد استفاده در درمان این مشکل و معضل اکثر گاوداری­های کشور، انجام گردید.

 

مواد و روش‌ها

   به منظور تهیه عصاره الکلی بره­موم، ابتدا مقدار 90 گرم بره­موم تازه تهیه­شده از کندو­های عسل منطقه شهرستان سراب واقع در شرق استان آذربایجان­شرقی به قطعات ریزتری تبدیل و سپس به آن 400 میلی­لیتر اتانول 96 درجه اضافه گردید و به مدت 18 ساعت در دمای آزمایشگاه قرار داده شد تا در اتانول حل شود. البته برای تسریع در حل شدن بره­موم، چندین بار مخلوط حاصله تکان داده ­شد تا عمل انحلال به خوبی و به­سرعت انجام گیرد. بعد از حل­شدن بره­موم، مخلوط مذکور به مدت 15 دقیقه در دمای 20 درجه سلسیوس در سرعت 7000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید. در ادامه محلول رویی به­دست آمده از عمل سانتریفیوژ در لوله آزمایش جمع­آوری شده و از کاغذ صافی واتمن شماره یک گذرانده ­شد تا عصاره خالص بره­موم به­دست آید. سپس رسوبات باقی­مانده مجدداً با 100 میلی­لیتر اتانول 96 درجه عصاره­گیری شد و مراحل قبل مجدداً تکرار ­گردید. به این­ترتیب عصاره غلیظ بره­موم تهیه گردید. لازم به­ذکر است که جهت حذف اتانول، سوسپانسیون مذکور به مدت 15 دقیقه در دستگاه تبخیر چرخشی در دمای کمتر از 50 درجه سانتی­گراد تکان داده می­شد (مرادی، 1388؛Najafi et al., 2007).

   در این مطالعه از 6 جدایه گرم مثبت و گرم منفی مربوط به ورم پستان گاوها شامل استافیلوکوکوس آرئوس، استرپتوکوکوس آگالاکتیه، استرپتوکوکوس دیسگالاکتیه، اشریشیا کولای،  کلبسیلا نومونیا و انتروباکتر آئروژنز که قبلاً در آزمایشگاه میکروب­شناسی گروه پاتوبیولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز از شیرهای آلوده ارجاعی مربوط به تعدادی از گاوداری­های منطقه تبریز جدا­شده و بر­ اساس روش­های بیوشیمیائی و بیولوژیکی استاندارد میکروب­شناسی تشخیصی، تعیین هویت شده­ بودند، استفاده گردید (طباطبائی و فیروزی1380). البته با توجه به­ این­که برای تهیه سوسپانسیون میکروبی نیاز به کشت 24­ساعته از هر باکتری بود، بنابراین 24­ساعت قبل از انجام هر آزمایش، مقداری از کشت ذخیره هر کدام از جدایه­های مورد آزمایش را به­طور جداگانه به محیط کشت BHI agar تلقیح و به مدت 24­ ساعت در دمای 37­ درجه سلسیوس­ گرم­خانه­گذاری می­گردید. سپس کلونی­های خالص ایجاد شده مربوط به هر جدایه در سطح محیط کشت مذکور جداگانه با محلول نرمال سالین شسته­شده و سوسپانسیون میکروبی به‌دست آمده دوباره با محلول مذکور تا حدی رقیق می­گردید تا کدورت ایجاد­شده در لوله حاوی سوسپانسیون میکروبی هر یک از جدایه­ها، معادل کدورت لوله استاندارد 5/0 مک‌فارلند تنظیم گردد. یعنی سوسپانسیون میکروبی همه جدایه­های مورد استفاده در آزمایش­های مختلف انجام گرفته، حاوی CFU/ml108´5/1 از جدایه­های مورد آزمایش بودند (Babayi et al., 2004).

   به­منظور بررسی اثرات ضد­باکتریایی عصاره الکلی بره­موم مورد آزمایش ابتدا از روش انتشار در آگار  (Disk Agar Diffusion) استفاده شد. لازم به توضیح است که بدین­منظور از دیسک­های بلانک استریل ساخت شرکت پادتن طب (تهران- ایران) استفاده گردید. به­ این­ ترتیب که دیسک­های بلانک در لوله­های حاوی عصاره مذکور قرار داده شد و بعد از مدت30 تا 50 دقیقه و پس از جذب­شدن کامل آن­ها توسط دیسک­، دیسک­های مذکور در دمای حدود 45 درجة سانتی­گراد قرار داده می­شد تا کاملاً خشک شوند. سپس در مورد همه جدایه­های مورد آزمایش به­طور جداگانه، با استفاده از 100میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی که مطابق استاندارد لوله 5/0 مک فارلند تهیه شده بود، بر سطح محیط مولرهینتون آگار جداگانه کشت یکنواخت انجام و سپس دیسک­گذاری می­شد. درادامه پلیت­ها به مدت  24  الی 48 ساعت در دمای 37 درجة سلسیوس انکوبه­شده و نتایج اثر ضدباکتریایی عصاره مورد آزمایش به­طور جداگانه و با اندازه­گیری قطر هاله عدم رشد اطراف دیسک­های مذکور با استفاده از خط­کش میلی­متری ثبت می­شد. لازم به ذکر است که برای حصول اطمینان بیشتر، این آزمایش برای هر یک از جدایه­های مورد آزمایش جداگانه سه بار تکرار شده و سپس میانگین محاسبه­شده به عنوان قطر نهایی منطقه عدم رشد آن جدایه ثبت می­شد. در آزمایش مذکور از آنتی­بیوتیک­های استاندارد تتراسایکلین (30 میکروگرم بر دیسک) به­عنوان کنترل جدایه­های گرم منفی و آمیکاسین (30 میکروگرم بر دیسک) به عنوان کنترل جدایه­های گرم مثبت استفاده می­گردید (Anzabi and  Khaki, 2015). در ادامه با استفاده از روش رقت لوله‌ای حداقل غلظت ممانعت از رشد (MIC) و حداقل غلظت باکتری­کشی (MBC) عصاره مورد آزمایش به­طور جداگانه تعیین گردید. برای تعیین MIC عصاره، از یک سری 10تایی از لوله­های آزمایش استفاده می­شد، به این صورت که 8 لوله برای آزمایش روی رقت­های مختلف عصاره و یک لوله به عنوان کنترل مثبت و یک لوله هم به عنوان کنترل منفی به­کار رفت. روش کار به این صورت بود که لوله شماره 1حاوی mg/ml 1 از عصاره بود و سپس رقت­های سریال تهیه می­شد تا اینکه لوله شماره 8 دارای mcg/ml 8/7 از ترکیب مذکور می­شد. همچنین همه لوله­ها حاوی  ml9 از محیط کشت broth  BHIو ml 1 از سوسپانسیون میکروبی مربوط به هر یک از جدایه­های مورد آزمایش هم بودند. لازم به ذکر است که در هر سری از آزمایشات مذکور هم­زمان یک لوله حاوی ml 9 از محیط کشت یادشده به علاوه  ml1 از عصاره به عنوان کنترل عصاره و نیز یک لوله حاوی ml 9 از همان محیط کشت به علاوه ml  1 از سوسپانسیون میکروبی هم به عنوان کنترل جدایه، استفاده می­شد. در ادامه همه لوله­های آزمایش ذکر­شده در بالا به مدت 24ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه می­شد. پس از طی زمان انکوباسیون، همه لوله­ها از نظر کدورت ناشی از رشد باکتری­های مورد آزمایش بررسی می­گردید (برای افزایش دقت کار این آزمایش برای هر یک از جدایه­ها به­طور جداگانه 3 بار تکرار می­شد). در نهایت، بالاترین رقتی از عصاره مورد آزمایش که از افزایش کدورت ناشی از رشد جدایه مورد آزمایش ممانعت کرده بود، به عنوان MIC عصاره الکلی بره­موم نسبت به آن جدایه در نظر گرفته ­می­شد. همچنین در ادامه، از لوله­هائی که در آزمایش تعیین MIC در آن­ها عدم رشد باکتری مشاهـــده میگردید، نمونــه­برداری کرده و جهت تعیین MBC عصاره مورد آزمایش، جداگانه به روش پورپلیت (Pour-plate) کشت داده می­شد. بدین منظور ml 1 از محتویات لوله­های مربوط به آزمایش MIC  هر جدایه که در آن لوله­ها رشد باکتری متوقف شده و اصطلاحاً عدم رشد باکتری مشاهده گردیده بود، برداشت کرده و با ml 20 از محیط کشت agar BHIبه صورت مخلوط کردن، کشت داده و سپس همه پلیت­ها به مـــدت 24ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس گرمخانه‌گذاری شده و از نظر رشد باکتری و ایجاد کلنی مورد ارزیابی قرار می‌گرفت. در نهایت بالاترین رقتی که در واقع حاوی کمترین غلظت عصاره مورد آزمایش بود و در پلیت مربوط به آن رقت هیچ کلنی از باکتری­های مورد نظر مشاهده نمی­گردید، به­عنوان MBC عصاره بره­موم در مورد آن جدایه در نظر گرفته می­شد (Anzabi and  Khaki, 2015).

   برای تحلیل آماری ارتباط بین حساسیت آنتی‌بیوتیکی جدایه­ها نسبت به نوع ترکیب با خاصیت ضدباکتریائی (آنتی‌بیوتیک­های استاندارد استفاده شده و عصاره بره­موم) از آزمون­ آماری تی مستقل تحت برنامه آماری Spss 18 جهت مقایسه داده‌ها استفاده شد. تفاوت‌های مشاهده شده در میزان  MICو   MBCهر یک از جدایه­ها، از آمار توصیفی استفاده گردید. مقادیر 05/0>p معنی‌دار در نظر گرفته شد.

 

یافته‌ها

   نتایج حاصله از بررسی اثرات ضد­باکتریایی عصاره الکلی بره­موم و آنتی­بیوتیک­های استاندارد تتراسایکلین و آمیکاسین با استفاده از آزمایش حساسیت آنتی­بیوتیکی به روش انتشار دیسک در آگار و همچنین نتایج مربوط به آزمایشات بررسی اثرات ممانعت از رشد و باکتری­کشی عصاره بره­موم بر جدایه­های مورد آزمایش که به­طور جداگانه انجام گرفته است، در جداول 1، 2 و 3 نشان داده شده است.

 

 

       

 

 

 

 

 

جدول 1- میانگین قطر منطقه عدم رشد جدایه­ها بر حسب میلی­متر در آزمایش حساسیت آنتی­بیوتیکی (mean ±SD)

جدایه­های مورد آزمایش

آنتی­بیوتیک آمیکاسین (30 میکروگرم در دیسک)

آنتی­بیوتیک  تتراسایکلین (30 میکروگرم در دیسک)

عصاره الکلی بره­موم (30 میکرولیتر در دیسک)

اشریشیا کولای

 

(---)

b2/0±13

a2/0±23

کلبسیلا نومونیا

(---)

b2/0±12

a2/0± 26

انتروباکتر آئروژنز

(---)

2/0±16

2/0±18

استافیلوکوکوس آرئوس

2/0±11

(---)

2/0±17

استرپتوکوکوس آگالاکتیه

2/0±15

(---)

2/0±22

استرپتوکوکوس دیسگالاکتیه

2/0±13

(---)

2/0±16

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                حروف غیرمشابه (a,b) در هر ردیف نشانگر اختلاف معنی­دار می­باشد (05/0p<).

               علامت (---) نشان­دهنده عدم استفاده از آنتی بیوتیک مذکور در مورد جدایه آن ردیف می باشد.

 

 

جدول 2- نتایج آزمایشات تعیین (MIC) عصاره الکلی بره موم در مورد هریک از جدایه­ها

 

رقت­های مختلف استفاده شده از عصاره الکلی بره­موم (µg/ml)

جدایه­های مورد آزمایش

8/7

625/15

25/31

5/62

125

250

500

1000

اشریشیا کولای

+

+

+

+

-

-

-

-

کلبسیلا نومونیا

+

+

+

+

+

-

-

-

انتروباکتر آئروژنز

+

+

+

+

-

-

-

-

استافیلوکوکوس آرئوس

+

+

+

+

+

+

-

-

استرپتوکوکوس آگالاکتیه

+

+

+

+

-

-

-

-

استرپتوکوکوس دیسگالاکتیه

+

+

+

+

+

-

-

-

 

 

جدول 3- نتایج آزمایشات تعیین حداقل غلظت باکتری­کشی (MBC) غلظت­های مختلف عصاره الکلی بره­موم

 

رقت­های مختلف استفاده شده از عصاره الکلی بره­ موم (µg/ml)

جدایه­های مورد آزمایش

8/7

625/15

25/31

5/62

125

250

500

1000

اشریشیا کولای

+

+

+

+

+

-

-

-

کلبسیلا نومونیا

+

+

+

+

+

+

-

-

انتروباکتر آئروژنز

+

+

+

+

+

-

-

-

استافیلوکوکوس آرئوس

+

+

+

+

+

+

+

-

استرپتوکوکوس آگالاکتیه

+

+

+

+

+

-

-

-

استرپتوکوکوس دیسگالاکتیه

+

+

+

+

+

+

-

-


بحث و نتیجه­گیری

   در مطالعه حاضر بررسی حساسیت آنتی­بیوتیکی به‌ روش انتشار در آگار نشان داد، علاوه بر این­که بره­موم استفاده شده به­عنوان یک ترکیب طبیعی با منشأ گیاهی قدرت انتشار خوبی در سطح محیط کشت جامد دارد، بلکه قطر منطقه عدم رشد ایجاد شده توسط این ترکیب در مورد همه جدایه­ها به مراتب بزرگتر از قطر ایجاد شده توسط آنتی­بیوتیک­های استاندارد مورد آزمایش یعنی تتراسیکلین و آمیکاسین می­باشد به­طوری­که، با توجه به جدول 1 تاثیر ضد­باکتریائی 30 میکرولیتر از عصاره الکلی بره­موم بر همه جدایه­های مورد آزمایش به­طور نسبی بیشتر از تاثیر 30 میکرولیتر از آنتی‌بیوتیک­های استاندارد تتراسیکلین و آمیکاسین بوده است. در واقع مشخص گردید که عصاره اتانولی بره­موم فعالیت ضدباکتریایی به مراتب بهتری در مقایسه با آنتی­بیوتیک­های مذکور دارد، ­طوری­که از نظر خاصیت ضد باکتریائی، بین آنتی­بیوتیک­های استاندارد استفاده شده (آمیکاسین و تتراسایکلین) و عصاره الکلی بره موم از یک طرف و مقاومت یا حساسیت جدایه‌های مورد آزمایش نسبت به ترکیبات مذکور از طرف دیگر، اختلاف مشخص وجود دارد که این تفاوت در مورد 2 جدایه گرم منفی مهم مورد آزمایش یعنی اشریشیا کولای و کلبسیلا نومونیا معنی­دار می­باشد. این یافته­ها هم‌سو با نتایج مطالعه موهان­نیر و همکاران وی در سال 2005 در مورد اثر ضد ­لیستریایی گیاه سیاه دانه در محیط کشت می­باشد، چرا که در آن تحقیق هم مشخص گردیده که عصاره­های مختلف گیاه مذکور عملکرد بهتری علیه باکتری لیستریا داشتند و در واقع اثر ضد ­لیستریائی گیاه سیاه دانه بسیار بیشتر از آنتی­بیوتیک جنتامایسین بوده است (Mohan Nair et al., 2005). البته از طرف دیگر در پژوهشی هم مشاهده شده است که آنتی­بیوتیک­های تتراسایکلین و تایلوزین دارای اثرات ضد­باکتریائی به مراتب قوی­تری نسبت به بره­موم در مورد باکتری Paenibacillus larvae   بوده­اند (Alippi et al., 2005). این درحالی است ­که، در بررسی حاضر آنتی­بیوتیک تتراسایکین (30 میکروگرم در دیسک) بر همه جدایه­های گرم منفی مورد آزمایش اثر ضدباکتریائی کمتری در مقایسه با اثر عصاره الکلی بره­موم (30 میکرولیتر در دیسک) نشان داد. به­نظر می‌رسد که عدم هم­خوانی در نتایج مشاهده شده در مطالعات مشابه در خصوص مقایسه قدرت ضدباکتریائی عصاره بره­موم نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مختلف رایج، احتمالاً به نوع آنتی­بیوتیک­های مورد آزمایش و نیز مقادیر استفاده شده از ماده موثره آنها و نیز نوع باکتری مورد آزمایش هم ارتباط داشته باشد. در مطالعه کوجومگیف و همکاران در سال 1999 ویژگی ضد­باکتریایی بره­موم علیه استافیلوکوکوس آرئوس و اشریشیاکولای بررسی شد که نتایج‌شان نشان‌دهنده تاثیر مناسب بره­موم بر باکتری­های مذکور بوده که این یافته با نتایج بررسی حاضر کاملاً هم‌خوانی دارد. حتی ایشان اثبات کردند که کاربرد هم‌زمان بره­موم با برخی از آنتی­بیوتیک­ها اثر آن­ها را چندین برابر افزایش داده و در واقع از نظر خاصیت ضد­باکتریائی، بره­موم با آنتی­بیوتیک­های مورد آزمایش آن­ها اثر هم­افزائی نیز داشته است (Kujumgiev et al., 1999).

   در مطالعه ما نتایج حاصل از آزمایش­های MIC و MBC به­روش رقت لوله­ای نشان داده است که میزان مهار رشد جدایه­های مورد آزمایش توسط بره­موم با مقدار آن در رقت‌های استفاده شده رابطه مستقیم دارد، به­طوری­که با افزایش میزان بره­موم در هر رقت، از رشد جدایه­ها ممانعت به­عمل آمده و در نهایت در رقتی که نشان­دهنده MBC عصاره بره­موم در مورد هریک از جدایه­ها بود، رشد باکتریائی متوقف شده و در واقع هیچ کلنی هم تشکیل نشد. نتایج ثبت شده نشان می‌دهد که حداقل غلظت مهار­کنندگی عصاره الکلی بره‌موم برای جدایه­های گرم منفی یعنی اشریشیاکولای­، کلبسیلا نومونیا و انتروباکتر آئروژنز در مطالعه حاضر به ترتیب 125، 250 و 125 میکروگرم بر میلی­لیتر و همچنین حداقل غلظت باکتری­کشی این عصاره برای جدایه­های مذکور نیز به ترتیب برابر با 250، 500 و 250 میکروگرم بر میلی­لیتر بود. این در حالی­ است که حداقل غلظت مهارکنندگی عصاره مذکور برای جدایه‌های گرم مثبت مورد آزمایش یعنی استافیلوکوکوس آرئوس، استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس دیسگالاکتیه به ترتیب 500، 125 و250 میکروگرم بر میلی­لیتر ثبت شده است. همچنین حداقل غلظت باکتری­کشی این عصاره برای جدایه­های مذکور نیز به‌ترتیب برابر با 1000­، 250 و 500 میکروگرم بر میلی‌لیتر بود. در واقع به­طور کلی، نتایج حاصل از آزمایشات مربوط به تعیین MIC وMBC  عصاره بره‌موم هم در بررسی حاضر نشان داد که این عصاره بر همه جدایه­های مورد آزمایش دارای اثر ممانعت­ از رشد و باکتری­کشی نسبتاً خوبی می­باشد. البته همان‌طور که نتایج جدول 1 هم مشخص می‌کند، علی‌الخصوص این خواص در مورد جدایه­های گرم منفی به مراتب بیشتر و موثرتر بوده است. این در حالی­ است که بررسی­های مختلف نشان داده است که بره­موم بر باکتری­های گرم مثبت موثرتر از باکتری­های گرم منفی می­باشد که این تفاوت در تأثیر را غالباً ناشی از متفاوت بودن ساختمان دیواره سلولی باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی اعلام کرده‌اند (مرادی، 1388). در توجیه این عدم هم­خوانی می­توان به این نکته اشاره کرد که حساسیت باکتری­های گرم منفی در مقابل ترکیبات ضد میکروبی در مقایسه با باکتری­های گرم مثبت کمتر است. این خود به دلیل نوع ترکیبات موجود در دیواره سلولی این دسته از باکتری‌ها می‌باشد، که فقط دارای لایه نازکی از موکوپپتید بوده و قسمت اعظم ساختار دیواره سلولی آنها را لایه خارجی (outer membrane) تشکیل می‌دهد که عمدتاً از جنس لیپوپلی­ساکارید می­باشد این در حالی است ­که باکتری­های گرم مثبت در دیواره سلولی خود دارای مقدار زیادی ترکیب پیچیده و نسبتاً مقاوم موکوپپتیدی هستند و به همین علت در مقابل مواد ضد­باکتریایی مقاوم­تر هستند (Schaechter et al., 1989).

   از طرف دیگر با مقایسه نتایج بررسی حاضر با یافته­های مطالعات مشابه، شاهد برخی تشابهات و اختلافات دیگری هم هستیم به طوری­که،  برومفیت وهمکارانش در سال 1990 با بررسی اثرات ضد­باکتریایی بره­موم روی باکتری استافیلوکوکوس آرئوس قطر منطقه ممانعت از رشد را در آزمایش آنتی­بیوگرام 14 میلی­متر به­دست آورده­اند (Brumfitt et al., 1990). در حالی­که، نتایج ثبت شده در جدول 1 مطالعه حاضر این مقدار را در مورد جدایه­های استافیلوکوکوس آرئوس حدود 17 میلی­متر نشان می­دهد. همچنین طی مطالعه­ای، ولازگوئز و همکارانش در سال 2007 مقدار MIC عصاره اتانولی بره­موم را روی باکتری استافیلوکوکوس آرئوس 1/0 میلی­گرم در میلی­لیتر به­دست آورده­اند (Velazquez et al., 2007). همچنین در یک بررسی در سال 1985 مشخص شده است که بره­موم بر 209 سویه استافیلوکوکوس آرئوس موثر بوده و MIC آن در حد 1 میلی­گرم در میلی­لیتر و MBC آن نیز 12 میلی‌گرم در میلی­لیتر بوده است (Meresta and Meresta, 1988). این در حالی است کهMIC عصاره اتانولی بره­موم در مطالعه ما، در خصوص جدایه­های استافیلوکوکوس آرئوس، معادل 500 میکروگرم در میلی­لیتر و MBC مربوطه هم معادل 1000 میکروگرم در میلی­لیتر بوده است. در توجیه این عدم هم­خوانی­ها، می­توان به نوع ترکیبات موجود در عصاره که در مناطق مختلف می­تواند متفاوت باشد، اشاره کرد. در این خصوص اعلام شده است که منبع گیاهی و فصل تولید بره­موم و نیز نوع حلال استفاده شده در عمل عصاره‌گیری بر اثرات ضد­باکتریائی بره­موم تأثیر چشم‌گیری دارد و حلال­های آلی ترکیبات بیشتری از بره موم را آزاد کرده و لذا اثرات ضد­باکتریائی بیشتری حاصل می­شود (مرادی، 1388). در تأیید این موضوع حتی برخی از محققین اعلام نموده­اند که مقایسه نتایج مشاهده شده در مورد خواص ضد­باکتریائی ترکیبات گیاهی مختلف بسیار دشوار می­باشد که از دلایل این موضوع به تفاوت در روش­های مختلف آزمایشگاهی به هنگام بررسی خواص ضد باکتریائی عصاره­ها، نوع ترکیبات گیاهی و منابع تهیه آن­ها، مرحله رشد گیاه و نیز سویه­های باکتریائی مورد آزمایش­، اشاره نموده­اند. از طرف دیگر، در برخی از مطالعات انجام گرفته در گذشته، اعلام شده است که عصاره­های الکلی و اتری و نیز دیگر حلال­های آلی تاثیر مشخصی بر خواص ضد­باکتریائی داشته است. بنابر­این، از جمله دلایل مشاهده اختلاف چشمگیر در اثرات ضدباکتریائی بره­موم روی برخی از جدایه­های مورد آزمایش در مطالعه حاضر را می­توان به نوع مواد موثره موجود در عصاره و همچنین روش عصاره گیری و نیز نوع حلال  مرتبط دانست (Singh et al., 2003; Moreno et al., 2006). مخصوصاً این مطلب زمانی اهمیت بیشتری پیدا می­کند که بدانیم ساختار و ترکیبات موجود در بره­موم یک منطقه با منطقه دیگر متفاوت است وحتی بره­موم تولید شده در فصول مختلف یک منطقه نیز با فصول دیگر تفاوت دارد (Sforcin and Bankova,2011). البته لازم به­ ذکر است که در مطالعات متعددی گزارش نموده­اند که عصاره الکلی بره­موم اثرات ضدباکتریائی به مراتب بهتری دارد، که علت آن را آزاد شدن و تخلیص بهتر فلاونوئیدها که در واقع  مهمترین جز فعال بره­موم می­باشد، اعلام کرده اند (Viuda Martos et al., 2008) و حتی در این ارتباط نشان داده شده است که عصاره اتانولی بره­موم دارای ویژگی­های متعددی از جمله خواص ضد­باکتریایی، ضد­ویروسی، ضد­التهابی بوده و حتی محرک سیستم ایمنی هم می‌باشد (Kim et al., 2005).

   نتایج مطالعه ما نشان داد که بره­موم مورد آزمایش که از کندوهای زنبور­عسل منطقه سراب استان آذربایجان‌شرقی تهیه شده بود­، دارای اثرات ضدباکتریائی خوبی بر همه جدایه­ها بوده و از طرف دیگر نتایج آزمایشات حساسیت آنتی­بیوتیکی انجام گرفته هم نشان داد که قطر منطقه عدم رشدی که توسط آنتی­بیوتیک­های استاندارد در قبال اکثر جدایه­های مذکور ایجاد شده بود، به مراتب کوچکتر از قطر منطقه عدم رشد ایجاد شده توسط عصاره اتانولی بره­موم بود. اهمیت این موضوع زمانی بیشتر مشخص می­شود که بدانیم ترکیبات طبیعی انواع گیاهان بومی موجود در بیشتر مناطق جغرافیائی کشور پهناور ایران (مخصوصاً در منطقه استان آذربایجان­شرقی)، غالباً عوارض جانبی احتمالی آنتی‌بیوتیک­های ساختگی دست بشر را نداشته و همچنین از نظر اقتصادی هزینه به مراتب کمتری را به مصرف‌کنندگان تحمیل می­کند. از طرف دیگر بسیاری از ترکیبات طبیعی معمولاً اثرات مفید دیگری نظیر خاصیت آنتی­اکسیدانی و تقویت­کننده سیستم ایمنی را، علاوه بر خواص ضد­میکروبی، دارا هستند. ضمن اینکه بره­موم ماده­ای ایمن و در عین حال غیرسمی بوده که از جمله خواص  جالب آن اثرات ضدباکتریائی در مقابل  باکتری‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک­های رایج می­باشد (مرادی ، 1388).

   در نهایت، نتایج مطالعه حاضر نشان داد که استفاده از بره­موم می­تواند به عنوان جایگزینی مناسب برای آنتی‌بیوتیک‌های صناعی جهت مقابله با جدایه­های مورد آزمایش مخصوصاً انواع گرم منفی در نظر گرفته شود. البته، در این خصوص مطالعات بیشتری نیاز است تا بتوان اثرات ضد باکتریائی بره­موم و ترکیبات آن را دقیق­تر بررسی کرد. به­نظر می­رسد استفاده از سایر روش­های عصاره­گیری و یا استفاده از غلظت­های دیگری به غیر از غلظت­های به­کار برده شده در این بررسی و نیز مطالعه روی حیوانات آزمایشگاهی مناسب، می­تواند اثرات ضد باکتریائی بره­موم را بیشتر از این روشن نماید. همچنین با توجه به ویژگی‌های بسیار مفید ثابت شده در مورد بره­موم از یک­طرف و نتایج ضدباکتریائی نسبتاً مناسب به­دست آمده در مورد این ترکیب در مطالعه حاضر و اکثر پژوهش­های مشابه، به­نظر می­رسد که این ماده و ترکیبات مختلف آن می­توانند جایگاه ویژه­ای را جهت استفاده در علوم پزشکی و دامپزشکی داشته باشند.

طباطبائی، ع.ح. و فیروزی، ر. (1380). بیماری­های باکتریائی دام. انتشارات دانشگاه تهران، صفحات: 24-20، 43-37 و 227-223.

  • • خادم حقیقیان، ح.، علی­عسگرزاده ، ا. و کوشان، ی. (1390). گزارش یک مورد درمان زخم پای دیابتی با استفاده از بره­موم حرارت­دیده در داخل روغن زیتون. فصلنامه دانش و تندرستی دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی شاهرود، دوره 6، شماره 4، صفحات: 38-35.
• رضویان، ح.، خزاعی، ص.، کاظمی، ش. و سیدی، س.م. (1391). بره­موم زنبور­عسل و کاربرد آن برای سلامت دهان و دندان. مجله دانشکده دندان پزشکی اصفهان، دوره 8، شماره 5، صفحات: 11-1.

• سیدی، س.م و فرشینه عدل، م.ب. (1389). بره­موم­: داروئی طبیعی از کندوی زنبور­عسل­. ترجمه نشر نصوح اصفهان، ایران، چاپ سوم، صفحات: 148-107.

• مرادی، م. (1388). بررسی اثر ضد­باکتریائی بره­موم زنبورعسل روی باکتری Paenibacillus larvae عامل بیماری لوک آمریکائی زنبور­عسل. نشریه دامپزشکی (پژوهش و سازندگی)، شماره 83، صفحات: 62-57.

• هاتفی، م.،  محرابیان، ص.، نوحی، ا. و رفیعی طباطبایی، ر. (1387 ). بررسی خواص ضد جهش­زایی عصاره الکلی بره­موم به وسیله سالمونلا تیفی­موریوم و میکروزوم. مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اراک، سال 11، شماره 2، صفحات: 110-102.

• Alippi, A.M., Albo, G.N., Reynaldi, F.J. and De Giusti, M.R. (2005). In vitro and in vivo susceptibility of the honeybee bacterial pathogen Paenibacillus larvae subsp. Larvae to the antibiotic Tylosin. Veterinary Microbiology, 109(12): 47-55.

 •Almas, K., Mahmoud, A. and Dahlan, A. (2001). A comparative study of propolis and saline application on human dentin. A SEM study. Indian Journal of Dental Research, 12(1): 21-27.

• Anzabi, Y. and Khaki, A. (2015). Antibacterial Effects of the Essential Oils and Ethanol Extracts of the Native Plants; Ziziphora Clinopodioides on 3 Species of Urinary Tract Isolated Bacteria in Rats’ Experimental Model. Medical Journal of Tabriz University of Medical Sciences and Health Services, 37(3): 18-25.

 •Babayi, L., Kolo, J.I. and Ijah, U.J. (2004). The antimicrobial activities of methanolic extracts of Eucalyptus camaldulensis and Terminalia catappa against some pathogenic microorganisms. Biochemistry, 16(2): 106-110.

 •Banskota, A.H., Tezuka, Y.T. and Kadota, S. (2001) Recent-progress-in pharmacological research of propolis. Phytotherapy Research, 15(7): 561-571.

•Borrelli, F., Maffia, P., Pinto, L., Ianaro, A., Russo, A. and Capasso, F. (2002). Phytochemical compounds involved in the anti-inflammatory effect of propolis extract. Fitoterapia, 73(Suppl 1): S53-S63.

 •Brumfitt, W., Hamilton Miller, J.M. and Franklin, I. (1990). Antibiotic activity of natural products: propolis. Microbios, 62(250): 19- 22.

 •Chena, Ch.R., Shena, C.T., Wu, J.J., Yangb, H.L., Hsu, S.L. and Chang, C.M.J. (2009). Precipitation of sub-micron particles of 3, 5-diprenyl- 4hydroxycinnamic acid in Brazilian propolis from supercritical carbon dioxide anti-solvent solutions. The Journal of Supercritical Fluids, 50(2): 176-182.

• Isla, M.I. ( 2005). Study on propolis quality from Argentina. Biocell, 29(1): 60.

• Najafi, M.F., Vhedi, F., Seyyedin, M., Jomehzadeh, H.R. and Bozary, K. (2007). Effect of the water extracts of propolis on stimulation and inhibition of different celss. Cytotechnology, 54: 49-56.

•Marcucci, M.C. (1995). Propolis: Chemical composition, biological propertis and therapeutic activity. Apidologie, 26: 83-99.

• Meresta, T. and Meresta, L. (1988). Sensivity of Bacillus larvae to propolis extract in vitro. Medycyna Veterynaryina, 44(3): 169-170.

• Park, Y.K.,  Koo, M.H.,  Abreu,  J.A.,  Ikegaki, M., Cury, J.A. and Rosalen, P.L. (1998). Antimicrobal Activity of propolis on oral microorganisms. Current Microbiology, 3(1): 24-28.

• Mohan Nair, M.K., Vasudevan, P. and Venkitanarayanan, K. (2005). Antibacterial effect of black seed oils on Listeria monocytogenes. Journal of Food Control, 16(5): 395-398.

 •Kim, K.T., Yeo, E.J., Han, Y.S., Nah, S.Y. and Paik, H.D. (2005). Antimicrobial, anti-inflammatory, and anti-oxidative effect of water and ethanol-extracted Brazilian propolis. Food Science and Biotechnology, 14:474-478.

• Tosi, E.A., Re, E., Ortega, M.E. and Cazzoli, A.F. (2007). Food preservative based on propolis: bacteriostatic activity of propolis polyphenols and flavonoids up on Escherichia coli. Food Chemistry, 104(3): 1025-1029.

• Khalil, M.L. (2006). Biological activity of bee propolis in health and disease. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 7(1): 22-31.

• Velazquez, C., Narvarro, M., Acosta, A., Angulo, A., Dominguez, Z., Robles, R., et al. (2007). Antibacterial and free-radical scavenging activities of sonoran propolis. Journal of Applied Microbiology, 103(5): 1747-1756.

• Park, Y.K., Alencar, S.M. and Aguiar, C.L.(2002). Botanical origin and chemical composition of Brazilian propolis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(9): 2502-2506.

 •Seidel, V., Peyfoon, E., Watson, D.G. and Fearnley, J. (2008). Comparative study of the antibacterial activity of propolis from different geographical and climatic zones. Phytotherapy Research, 22(9): 1256-1263.

• Orsi, R., Sforcin, J., Rall, V., Funari, S., Barbosa, L. and Fernandes, J. (2005). Susceptibility profile of Salmonella against the antibacterial activity of propolis produced in two regions of Brazil. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases, 11(2): 109.

• Kujumgiev, A., Tsvetkova, I., Serkedjieva, Y., Bankova, V., Christov, R. and Popov, S. (1999). Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis of different geographic origin. Journal of Ethnopharmacology, 64(3): 235-240.

• Viuda Martos, M., Ruiz Navajas, Y., Fernandez Lopez, J. and Perez Alvarez, J.A. (2008). Functional properties of honey, propolis, and royal jelly. Journal of Food Science, 73(9): 117-124.

• Sforcin, J.M. and  Bankova, V. (2011). Propolis: is there a potential for the development of new drugs? Journal of Ethnopharmacology, 133(2): 253-260.

• Schaechter, M., Medoff, G. and Fchlessinger, D. (1989). Mechanisms of Microbial Disease. International Edition (Williams and Wilkins): 17-50.

 •Moreno, S., Scheyer, T., Romano, C.S. and Vojnov, A.A. (2006). Antioxidant and antimicrobial activities of rosemary extracts linked to their polyphenol composition. Free Radical Research, 40(2): 223-231.

• Singh, A., Singh, R.K., Bhunia, A.K. and Singh, N. (2003). Efficacy of plant essential oils as antimicrobial agents against Listeria monocytogenes in hotdogs. Food Science & Technology, 36(8):787-794.