مطالعه اثرات محافظتی کروسین بر آسیب ایسکمی-بازخونرسانی تجربی کبد در موش صحرایی

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

1 دانشیار گروه آموزشی علوم درمانگاهی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.

2 استاد گروه آموزشی پاتوبیولوژی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.

چکیده

   خونرسانی مجدد پس از ایسکمی ممکن است باعث بروز آسیب­های متابولیکی و ساختاری در کبد شود. هدف از این مطالعه ارزیابی تاثیر کروسین بر آسیب ایسکمی-بازخونرسانی کبد در موش­های صحرایی بود. بدین منظور 40 سر موش صحرایی نژاد ویستار به‌طور تصادفی به چهار گروه 10 تایی تقسیم شدند: 1- گروه شاهد: موش­های دستکاری نشده؛ 2- گروه کنترل جراحی: موش­هایی که تحت جراحی به­جز ایسکمی-بازخونرسانی قرار گرفته و نرمال سالین دریافت کردند؛ 3- گروه ایسکمی-بازخونرسانی: موش­هایی که 45 دقیقه تحت ایسکمی، سپس 45 دقیقه دیگر در معرض خونرسانی مجدد کبد قرار گرفتند؛ 4- گروه ایسکمی-بازخونرسانی و تیمار با کروسین: موش­هایی که با کروسین (200 میلی­گرم بر کیلوگرم، داخل صفاقی) مورد پیش­درمانی قرار گرفتند. موش­ها پس از اخذ نمونه­های خون و بافت کبد آسان­کشی شدند. آلانین آمینو ترانسفراز، آسپارتات آمینو ترانسفراز و لاکتات دهیدروژناز سرم اندازه­گیری شد. مالون­دی­آلدئید و فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز در هموژنات بافت کبد اندازه­گیری شد. همچنین، آسیب­شناسی بافتی کبد توسط میکروسکوپ نوری انجام شد. در گروه 4،  کروسین به‌طور معنی‌داری (001/0>p) میزان افزایش­یافته آنزیم‌های شاخص آسیب کبد را کاهش و به­طور معنی­داری  (001/0>p)  میزان پراکسیداسیون لیپیدی را کاهش و سطوح  کاهش­یافته آنتی­اکسیدان­های کبد­ را افزایش داد.  آسیب­ بافتی به­طور معنی­داری در کبدهای تیمار شده با کروسین کاهش پیدا کرد. این نتایج نشان می­دهد که کروسین با خواص آنتی‌اکسیدانی خود، دارای اثرات محافظتی در برابر آسیب ایسکمی-بازخونرسانی کبد بوده و انتخاب مناسبی برای درمان آسیب­های مرتبط با ایسکمی-بازخونرسانی کبد می­باشد.  

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Protective effects of Crocin on experimental hepatic ischemia-reperfusion injury in the rat

نویسندگان [English]

  • bahram Amouoghli Tabrizi 1
  • daryoush Mohajeri 2
چکیده [English]

   Ischemia followed by reperfusion (I/R) may cause metabolic and structural hepatic damage. The aim of this study was to investigate the effects of crocin on liver ischemia/reperfusion (I/R) injury in rats. For this purpose a total of 40 male Wistar rats were randomized into four groups of ten: (1) controls: including unmanipulated rats; (2) sham group: rats subjected to the surgical procedure, except for liver I/R, and given saline; (3) I/R group: rats underwent liver ischemia for 45 minutes followed by reperfusion for 45 minutes; (4) I-R/Crocin group: rats pretreated with crocin (200 mg/kg, ip). Blood samples and liver tissues were harvested from the rats, and then the rats were sacrificed. Serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and lactate dehydrogenase (LDH) levels were determined. Malondialdehyde (MDA) and activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) were assayed in liver homogenates. Also liver tissue histopathology was evaluated by light microscopy. In group 4, crocin significantly (p<0.001) decreased the elevated levels of serum biomarkers of hepatic injury and significantly (p<0.001) decreased the lipid peroxidation and elevated the decreased values of hepatic antioxidants. Histopathological changes were significantly attenuated in crocin-treated livers. These results suggest that crocin because of its anti-oxidant potential, has protective effects against hepatic I/R injury, and is a potential therapeutic drug for ischemia reperfusion-related liver injury.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Crocin
  • Ischemia-reperfusion
  • liver
  • Rat

مقدمه

   خونرسانی مجدد پس از ایسکمی کبد ممکن است  به آسیب متابولیک و ساختاری آن منجرشود. آسیب ایسکمی-بازخونرسانی کبد ممکن است به علت تروما، عفونت، پیوند کبد (Shin et al., 2008) و یا بستن ساقه کبدی در طی اعمال جراحی کبد (van Gulik et al., 2007) ایجاد شود. این آسیب به عنوان  مشکلی  جدی برای اعمال جراحی کبد مطرح می‌باشد که باعث ایجاد محدودیت در اعمال جراحی  پیوند کبد می­گردد (He et al., 2005).

رادیکال­های آزاد اکسیژن که در برقراری مجدد جریان خون تولید می­شوند، نقش مهمی را در آسیب ناشی از ایسکمی-بازخونرسانی بر عهده دارند (Hassan-Khabbar et al., 2008). رادیکال­های فعال اکسیژن منجر به یک پاسخ التهابی و آسیب بافتی با فعال کردن برخی از واسطه­ها می­شوند. این رادیکال­ها همچنین می­توانند به­طور مستقیم به محتویات و اجزای سلولی آسیب برسانند (Montalvo-Jave et al., 2008). تلاش­های فراوانی برای کاهش آسیب ایسکمی-بازخونرسانی انجام شده است. حفاظت در برابر آسیب خونرسانی مجدد را می­توان با درمان­های مناسب از جمله کاربرد آنتی اکسیدان­ها و داروهای ضد التهابی اجرا نمود (Polat et al., 2008; Pulitano et al., 2008; Shen et al., 2007).

   شرایط پاتولوژیک نظیر سرطان­ها، پیری، بیماری­های قلبی-عروقی، ایسکمی و آماس در تولید و تجمع گونه­های فعال اکسیژن دخیل هستند (Barber and Harris, 1994; Das and Maulik, 1994). بنابراین، از بین بردن گونه­های رادیکال اکسیژن یک راهکار تدافعی موثری در برابر بیماری­های مختلف قلمداد می­شود. آنتی‌اکسیدان‌ها موادی هستند که در صورت وجود در غذا‌ها و بدن، حتی در مقادیر ناچیز، می‌توانند بدن را در مقابل انواع مختلف آسیب‌های اکسیداتیو ناشی از گونه‌های فعال اکسیژن محافظت کنند (Sanches-Moreno et al., 1999).

   کروسین (crocin) به عنوان یک کاروتنوئید گلیکوزیله دارای اثرات فارماکولوژیک متعدد از جمله محافظت از آسیب ناشی بیماری­های قلبی-عروقی (Xiang et al., 2006)، جلوگیری از پرولیفراسیون سلول­های توموری (Magesh et al., 2006)، محافظت از سیستم عصبی (Ahmad et al., 2005) و محافظت از هپاتوسیت­ها (Tseng et al., 2005) می‌باشد. در هر صورت، در بین مکانیسم­های محافظتی مختلف، فعالیت آنتی­اکسیدانی کروسین مسئول اثرات فارماکولوژیکی آن قلمداد شده است (Chen et al., 2008).

   بررسی­های انجام شده توسط حسین­زاده و همکاران در سال 2005 نشان داده است که کروسین قادر است بافت کلیه موش­های صحرایی را در برابر آسیب اکسیداتیو ناشی از ایسکمی-بازخونرسانی به طور کامل محافظت کند (Hosseinzadeh et al., 2005). مطالعات انجام شده توسط زنگ و همکاران در سال 2007 نشان داده است که کروسین آسیب اکسیداتیو-نیتراتیو ناشی از خونرسانی مجدد را در بافت مغز کاهش می­دهد (Zheng et al., 2007). حسین­زاده و همکاران در مطالعه­ای در سال 2009 نشان دادند که کروسین آسیب ناشی از ایسکمی-بازخونرسانی را در عضله اسکلتی موش صحرایی کاملاً بهبود می­بخشد (Hosseinzadeh et al., 2009).

   با بررسی منابع مشخص شده است که تاکنون مطالعه‌ای در مورد تاثیر محافظتی کروسین در برابر آسیب ایسکمی-بازخونرسانی کبد در موش صحرایی انجام نشده است. بنابراین، مطالعه حاضر برای اولین بار جهت ارزیابی اثرات محافظتی کبد در برابر آسیب ایسکمی-بازخونرسانی کبد انجام می­گردد.

   با توجه به اثرات آنتی­اکسیدانی کروسین، این ماده احتمالاً توانایی آن را خواهد داشت که بتواند کبد را از آسیب‌های ناشی از تنش­های اکسایشی در خونرسانی مجدد پس از ایسکمی محافظت کند.

   با انجام این مطالعه خاصیت دارویی کروسین در محافظت از بافت کبد در شرایط ایسکمی-بازخونرسانی مورد ارزیابی قرار می‌گیرد که در صورت تائید می‌تواند به عنوان یک منبع قابل دسترس با خاصیت آنتی‌اکسیدانی مورد استفاده قرار گیرد.

 

مواد و روش­ها

   مطالعه حاضر از نوع تجربی آزمایشگاهی بود و در سال 1394 در محل مرکز تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی تبریز انجام شد. برای انجام این مطالعه،  از 40 سر موش صحرایی نر بالغ نژاد ویستار با وزن تقریبی 20200 گرم و در محدوده سنی 9 هفته استفاده شد. شرایط تغذیه و نگه­داری برای تمام گروه‌ها یکسان و به صورت 12 ساعت روشنایی/تاریکی و دمای 221 درجه سلسیوس بود. جیره غذایی یکسان و آب نیز به‌طور آزاد در دسترس قرار گرفته و پس از یک هفته عادت به شرایط جدید، آزمایش شروع شد. موش‌ها به‌طور تصادفی به 4  گروه مساوی تقسیم شدند:  1- گروه شاهد: در مورد موش­های این گروه هیچ­گونه مداخله جراحی و دستکاری کبد انجام نشد؛ 2- گروه شاهد جراحی: موش­های این گروه مشابه با گروه ایسکمی-بازخونرسانی تحت عمل جراحی قرار گرفته ولی متحمل ایسکمی-بازخونرسانی کبد نشدند. این موش­ها به مدت برابر با گروه ایسکمی-بازخونرسانی  (45 دقیقه ایسکمی و 45 دقیقه بازخونرسانی) تحت بیهوشی قرار گرفته و قبل از القا ایسکمی، نرمال سالین را به طور داخل صفاقی دریافت کردند؛ 3- گروه ایسکمی-بازخونرسانی: موش­های این گروه تحت عمل جراحی قرار گرفته و به مدت 45 دقیقه تحت ایسکمی، سپس 45 دقیقه دیگر تحت خونرسانی مجدد کبد قرار گرفتند؛ 4- گروه ایسکمی-بازخونرسانی و تیمار با کروسین: موش­های این گروه تحت عمل جراحی قرار گرفته و به مدت 45 دقیقه تحت ایسکمی، سپس 45 دقیقه دیگر تحت خونرسانی مجدد کبد قرار گرفتند. این موش­ها کروسین (Fluka Chemicals, UK) را با دز 200 میلی­گرم بر کیلوگرم به طور داخل صفاقی 15 دقیقه قبل از القا ایسکمی دریافت کردند. میزان و روش مصرف کروسین بر اساس مطالعات قبلی در مورد تاثیر کروسین بر آسیب ایسکمی-بازخونرسانی کلیه در موش صحرایی انتخاب شد (Hosseinzadeh et al., 2005). مدت زمان القاء ایسکمی در بافت کبد نیز بر اساس مطالعه گدیک و همکاران در سال 2008 در مورد تاثیر رزوراترول بر استرس اکسیداتیو و تغییرات بافتی ناشی از آسیب ایسکمی-بازخونرسانی کبد در موش صحرایی انتخاب شد (Gedik et al., 2008). در این مطالعه کلیه ملاحظات اخلاقی و پروتکل‌های کار بر روی حیوانات آزمایشگاهی مورد تائید کمیته نظارت بر حقوق حیوانات آزمایشگاهی بود.

برای انجام جراحی، موش­ها با تزریق داخل صفاقی کتامین هیدرو کلراید mg/kg 100 و زایلازین mg/kg 20 بیهوش شدند. بعد از تراش موها و ضدعفونی پوست ناحیه شکم، برش خط وسط (midline incision) ایجاد شد. پس از آشکارسازی ناف کبد، سرخرگ مشترک کبدی (common hepatic artery) و سیاهرگ پورتال (portal vein) مشخص و به مدت 45 دقیقه به­وسیله گیره­­های نان­تروماتیک عروقی مسدود شدند. پس از برداشتن گیره­ها و رفع انسداد، خونرسانی مجدد به مدت 45 دقیقه انجام شد (Gedik et al., 2008).

   جهت اندازه‌گیری برخی فاکتور‌های بیوشیمیایی  شامل آلانین آمینو ترانسفراز، آسپارتات آمینو ترانسفراز (Reitman and Frankel, 1957) و لاکتات دهیدروژناز (Martinek, 1972)، 5 میلی­لیتر خون از آئورت شکمی موش­ها اخذ گردید.

   برای سنجش فعالیت آنتی اکسیدانی در بافت کبد، موش­ها به آسانی با تزریق دز بالای پنتوباربیتال سدیم (sodium pentobarbital) کشته شدند.  کبد موش­ها سریعاً خارج و به دو قسمت تقسیم شد. یک قسمت در سالین بسیار سرد شستشو و از آن هموژنات 10%  (یک حجم بافت در 9 حجم بافر هموژناسیون) تهیه شد. به این صورت که، قطعات بافت کبد در 150 میلی­لیتر بافر هموژناسیون (Tris-HCl 20 میلی­مول، 8/7 pH= حاوی استات منیزیم و کلرید پتاسیم 30 میلی­مول و سوکروز 25/0 مول) ریخته شد، سپس توسط دستگاه هموژنایزر به مدت 5/1 دقیقه تحت عمل هموژناسیون قرار گرفت. هموژنات بافتی پس از صاف شدن با سرعت 7000 دور در دقیقه و به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شده و محلول شناور (supernatant) جهت سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدی (LPO) از طریق اندازه­گیری مقدار مالون‌دی‌آلدئید (MDA malondialdehyde;) و همچنین برای اندازه­گیری فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی سوپراکسید دیسموتازSOD)  superoxide dismutase;)، کاتالاز (‍‍CAT catalase;)، گلوتاتیون پراکسیداز (GPX glutathione peroxidase;) و گلوتاتیون ردوکتاز (GR glutathione reductase) مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی مورد مطالعه و میزان MDA با استفاده از کیت­های تجاری موجود  (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) و طبق دستورالعمل شرکت تولید کننده کیت انجام شد. مقدار MDA بافتی به صورت نانومول مالون­دی­آلدئید (nmol) در میلی­گرم پروتئین و فعالیت آنتی­اکسیدانی به صورت واحدهای قراردادی در میلی­گرم پروتئین عنوان گردید.

پراکسیداسیون چربی در بافت کبد با روش رنگ­سنجی (colorimetrically) به وسیله اندازه­گیری TBARS (thiobarbituric acid reacting substances) طبق روش فراگا و همکاران در سال 1988 انجام شد (Fraga et al., 1988). به طور خلاصه: 1/0 میلی لیتر هموژنات بافتی با 2 میلی لیتر معرف (Thiobarbituric acid; TBA- trichloroacetic acid, TCA-Hcl) (37% TBA، 25/0 مول HCL و 15% TCA، به نسبت 1:1:1) مخلوط و پس از 15 دقیقه قرارگیری در بن ماری جوشان، خنک گردید و در g 3500 به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شد. شدت جذب محلول رویی شفاف در nm 535 در مقابل بلانک اندازه­گیری گردید. مقادیر به صورت نانومول بر100 گرم بافت بیان شدند.

   فعالیت سوپراکسید دیسموتاز توسط روش نیشیکیمی  و همکاران تعیین گردید (Nishikimi et al., 1972). در حدود 5 میکروگرم از پروتئین­های تام هر یک از هموژنات­های کبد با بافر پیروفسفات سدیم، فنازین متوسولفات (PMT phenazine methosulfate;) و نیترو-بلو تترازولیوم (Nitro-blue Tertazolium; NBT) مخلوط گردید. واکنش با افزودن نیکوتین­آمید-آدنین دی­نوکلئوتید (Nicotinamide-adenine dinucleotide; NADH) آغاز شد. مخلوط واکنش در دمای 30 درجه سلسیوس به مدت 90 ثانیه انکوبه و با افزودن 1 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال متوقف گردید. شدت جذب مخلوط رنگ­زای تشکیل شده در nm560 اندازه­گیری شد. هر واحد از فعالیت سوپراکسید دیسموتاز به صورت غلظت آنزیم مورد نیاز برای ممانعت از تولید رنگ تا 50 درصد در 1 دقیقه، تحت شرایط مطالعه، تعیین گردید.

   فعالیت کاتالاز توسط روش کلایبورن و بر اساس تجزیه پراکسید هیدروژن در nm240، مورد سنجش قرار گرفت (Claiborne, 1985). به‌طور خلاصه، مخلوط مورد سنجش متشکل از 95/1 میلی لیتر بافر فسفات (7M, pH=  05/0)، 1 میلی­لیتر پرکسید هیدروژن (M 019/0) و 05/0 میلی­لیتر PMS (10%) در حجم نهایی 3 میلی‌لیتر بود. تغییرات در جذب، در nm240 اندازه‌گیری شد. در نهایت نتیجه به شکل "فعالیت کاتالاز در دقیقه" محاسبه گردید.

فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز با استفاده از روش روتراک  و همکاران  (Rotruck et al., 1973) و بر اساس واکنش ذیل مورد سنجش قرار گرفت.

H2O2 + 2GSH (گلوتاتیون احیاء) → 2H2O + GSSG(گلوتاتیون اکسید)

   گلوتاتیون پراکسیداز، در هموژنات بافتی، گلوتاتیون را اکسیده کرده که به طور هم زمان پراکسید هیدروژن به آب احیاء می­گردد. این واکنش پس از 10 دقیقه توسط تری‌کلرواستیک اسید متوقف و گلوتاتیون باقیمانده توسط محلول دی­تیوبیس نیتروبنزوئیک اسید (Dithiobis nitrobenzoic acid; DTNB) مجدداً فعال گردیده و منجر به تشکیل ترکیب رنگی می­گردد که با اسپکتروفتومتر در nm 420 اندازه­گیری می­شود. مخلوط واکنشگر متشکل از 2/0 میلی‌لیتر اتیلن دی­آمین تترا-استیک اسید (ethylenediamine tetra-acetic acid; EDTA) mM 8/0، 1/0 میلی­لیتر آزید سدیم (sodium azide) mM 10، 1/0 میلی­لیتر پراکسید هیدروژن mM 5/2 و 2/0 میلی­لیتر هموژنات بود که در 37 درجه ‌سلسیوس به مدت 10 دقیقه انکوبه گردید. واکنش با افزودن 5/0 میلی­لیتر تری‌کلرواستیک اسید 10 درصد متوقف و لوله­ها با 2000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. 3 میلی­لیتر دی سدیم هیدروژن mM 8/0 و 1/0 میلی لیتر DTNB 04/0 درصد به محلول شناور افزوده شد و بلافاصله رنگ حاصله در nm 420 اندازه­گیری شد. فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز به صورت میلی­گرم پروتئین/دقیقه/میکرومول گلوتاتیون اکسید بیان گردید.

   فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز با استفاده از روش مهنداس و همکاران (Mohandas et al., 1984) بر اساس واکنش ذیل مورد سنجش قرار گرفت.

NADPH + H+ + GSSG → NADP+ + 2GSH

   در حضور گلوتاتیون ردوکتاز، گلوتاتیون اکسیده، احیاء گردیده و هم زمان، NADPH به NADP+ اکسیده می‌شود. فعالیت آنزیم در دمای اتاق و با ناپدید شدن میزان NADPH در دقیقه با اندازه­گیری اسپکتروفتومتری کاهش جذب نوری در nm340، تعیین گردید.

   برای آسیب­شناسی بافتی، قسمت باقی مانده بافت کبد در فرمالین بافر 10 درصد پایدار شد. از نمونه‌های فوق با استفاده از شیوه‌های رایج پاساژ بافت و تهیه مقاطع هیستوپاتولوژی، برش‌هایی با ضخامت 5 میکرون و با روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین تهیه شد (Lee and Luna, 1988). شدت آسیب کبد بر اساس یک مقیاس نیمه کمی (semiquantitative scale) و دوسو کور طبق روش ارائه شده توسط فری و همکاران در سال 1984 ارزیابی گردید.  شدت آسیب، از صفر تا 4  (صفر: عدم وجود آسیب، 1: حداقل آسیب، 2: آسیب ملایم، 3: آسیب متوسط و 4: آسیب شدید) رتبه‌بندی شد (Frei et al., 1984). کلیه درجه‌‌بندی‌ها با بزرگنمایی 100× و در 5 میدان میکروسکوپی از هر برش، به‌طور تصادفی، با میکروسکوپ نوری مدل نیکون (ECLIPSE E200، ساخت کشور ژاپن) انجام شد.

   تحلیل آماری داده­ها: داده‌های به‌دست آمده کمّی، به صورت mean±S.E.M ارائه و اختلاف معنی‌دار بین گروه‌ها توسط آزمون تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA)  و آزمون تعقیبی توکی (Tukey) در سطح معنی‌داری 05/0p<  توسط نرم‌افزار آماری SPSS 17 مورد واکاوی آماری قرار گرفت.

 

یافته­ها

   در موش‌های صحرایی گروه 2 (کنترل جراحی)، تغییر معنی­داری در هیچ یک از پارامترهای مورد سنجش در مقایسه با گروه 1 (شاهد) ایجاد نشد. در موش‌های صحرایی گروه 3 (ایسکمی-بازخونرسانی مجدد)، سطوح سرمی آنزیم­های آلانین ‌آمینوترانسفراز، آسپارتات ‌آمینوترانسفراز و لاکتات دهیدروژناز در مقایسه با گروه 1 (شاهد)، به‌طور معنی‌داری (000/0p=) افزایش و آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز کبد به‌طور معنی‌داری (000/0p=) کاهش و میزان مالون­دی­آلدئید آن به طور معنی­داری (000/0p=) افزایش یافت. در گروه 4 (ایسکمی-بازخونرسانی مجدد به­علاوه تیمار با کروسین) تیمار با کروسین مانع از افزایش آنزیم‌های شاخص آسیب کبد در اثر آسیب ایسکمی-بازخونرسانی مجدد شد به­طوری که، تفاوت معنی­داری بین این گروه و  گروه شاهد سالم برآورد نگردید. همچنین کروسین مانع از افزایش مالون­دی­آلدئید و همچنین مانع از کاهش فعالیت و آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز در اثر آسیب ایسکمی-بازخونرسانی شد به­طوری که، تفاوت معنی­داری بین این گروه و  گروه 1 (شاهد) برآورد نگردید (جداول 1 و 2).

   در آسیب‌شناسی بافتی ساختار لوبولی و سلولی کبد در موش­های صحرایی گروه 1 (شاهد) سالم و طبیعی بود (شکل 1). هیچگونه تغییر پاتولوژیکی خاصی نیز در بافت کبد موش­های صحرایی گروه 2 (کنترل جراحی)،  مشاهده نشد به­طوری­که، ساختار بافتی کبد، کاملاً طبیعی به نظر می­رسید (شکل 2). در کبد موش­های صحرایی گروه 3 (ایسکمی-بازخونرسانی مجدد)، نکروز هپاتوسیت­ها توام با ارتشاح متوسط سلول­های آماسی در اطراف وریدچه مرکزی و آماس شدید در ناحیه پورتال همچنین کانون­های پراکنده نکروز در قسمت­های مختلف لوبول­های کبدی  مشاهده می­شد (شکل 3). در گروه 4 (ایسکمی-بازخونرسانی مجدد به­علاوه تیمار با کروسین)، تیمار با کروسین، به­طور قابل توجهی مانع از بروز تغییرات پاتولوژیک در بافت کبد موش­های صحرایی شده بود و تنها آسیب قابل مشاهده، واکوئولاسیون سیتوپلاسم هپاتوسیت­ها به­خصوص در اطراف وریدچه مرکزی بود (شکل 4). مشاهدات ریزبینی بافت کبد موش­های صحرایی گروه­های تحت مطالعه به­طور کمّی در جدول 3 نشان داده شده است.

 

 

جدول 1- تاثیر کروسین بر فراسنجه­های بیوشیمیایی سرم موش ‌صحرایی در آسیب کبدی ناشی از ایسکمی-بازخونرسانی

گروه

تیمار

فراسنجه­های بیوشیمیایی

آلانین ‌آمینوترانسفراز

(U/L)

آسپارتات ‌آمینوترانسفراز

(U/L)

لاکتات دهیدروژناز (U/L)

1

شاهد

25/2±54/80 a

a37/5±84/159

a52/23±31/685

2

کنترل جراحی

54/2±62/82a

a62/4±21/163

a47/21±52/697

3

 ایسکمی-بازخونرسانی

38/3±42/181b

b15/7±67/235

b49/26±64/1125

4

ایسکمی-بازخونرسانی  به­علاوه تیمار با کروسین

a49/2±25/83

a81/4±95/168

a82/24±33/715

   مقادیر به­صورت میانگین ± انحراف استاندارد برای 10 سر موش صحرایی در هر گروه ارائه شده است.

a,b  : حروف غیرمشابه در هر ستون نشانگر اختلاف معنی­دار است (05/0p<).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 2- تاثیر کروسین بر فعالیت آنتی­اکسیدانی کبد موش ‌صحرایی در آسیب کبدی ناشی از ایسکمی-بازخونرسانی

گروه

تیمار

فراسنجه­های بیوشیمیایی

مالون‌دی‌آلدئید (nmol/g protein)

سوپراکسید دیسموتاز

(U/mg protein)

کاتالاز

(U/mg protein)

گلوتاتیون پراکسیداز (U/mg protein)

گلوتاتیون ردوکتاز (U/mg protein)

1

شاهد

16/0±21/4 a

a13/1±12/17

a52/4±11/72

a95/0±37/15

a52/3±61/123

2

کنترل جراحی

17/0±31/4a

a93/0±55/16

a82/3±75/67

a62/0±19/14

a40/3±34/117

3

 ایسکمی-بازخونرسانی

18/0±42/5b

b68/0±87/9

b26/3±85/42

b46/0±65/7

b89/1±62/75

4

ایسکمی-بازخونرسانی  به­علاوه تیمار با کروسین

a13/0±29/4

a74/0±83/15

a37/2±92/65

a54/0±82/13

a35/2±31/120

      مقادیر به­صورت میانگین ± انحراف استاندارد برای 10 سر موش صحرایی در هر گروه ارائه شده است.

      a,b: حروف غیرمشابه در هر ستون نشانگر اختلاف معنی­دار است (05/0p<).

 

جدول 3- تاثیر کروسین بر آسیب بافت کبد موش­های ‌صحرایی‌ ناشی از ایسکمی-بازخونرسانی

                   گروه­ها

درجه­بندی آسیب بافتی

شاهد

کنترل جراحی

ایسکمی-بازخونرسانی

ایسکمی-بازخونرسانی  به­علاوه تیمار با کروسین

پر خونی و آماس در ناحیه پورتال

 

درجه 0

10

10

0

5

درجه 1

0

0

0

4

درجه 2

0

0

0

1

درجه 3

0

0

7

0

درجه 4

0

0

3

0

نکروز

 

درجه 0

10

10

0

8

درجه 1

0

0

0

1

درجه 2

0

0

1

1

درجه 3

0

0

7

0

درجه 4

0

0

2

0

ارتشاح بینابینی سلول­های آماسی

 

درجه 0

10

9

0

7

درجه 1

0

1

0

2

درجه 2

0

0

3

1

درجه 3

0

0

6

0

درجه 4

0

0

1

0

صفر: عدم وجود آسیب، 1: حداقل آسیب، 2: آسیب ملایم، 3: آسیب متوسط و 4: آسیب شدید (10 نمونه در هر گروه ارائه شده است).

 


 

شکل 1- نمای ریز‌بینی از بافت کبد یک موش­های صحرایی از گروه شاهد که کاملاً سالم و طبیعی می­باشد (هماتوکسیلین-ائوزین، درشت‌نمایی 400×).

 

شکل 2- نمای ریز‌بینی از بافت کبد یک موش­های صحرایی از گروه کنترل جراحی که سالم به‌نظر رسیده و تغییر پاتولوژیک خاصی ندارد (هماتوکسیلین-ائوزین، درشت‌نمایی 400×).

 

 

 

شکل 3- نمای ریز‌بینی از بافت کبد یک موش­های صحرایی از گروه ایسکمی-بازخونرسانی که در آن تغییرات دژنراتیو و نکروز هپاتوسیت­ها در اطراف وریدچه مرکزی (پیکان­های ضخیم) و خونریزی‌های پراکنده (پیکان­های باریک) در قسمت­های مختلف لوبول­های کبدی مشاهده می­شود (هماتوکسیلین-ائوزین، درشت‌نمایی 400×).

 

شکل 4- نمای ریز‌بینی از بافت کبد یک موش­های صحرایی از گروه ایسکمی-بازخونرسانی  به­علاوه تیمار با کروسین که دژنرسانس هیدروپیک خفیفی (پیکان­ها) را در اطراف وریدچه مرکزی نشان می‌دهد (هماتوکسیلین-ائوزین، درشت‌نمایی 400×).


 


بحث و نتیجه­گیری

   تولید رادیکال­های آزاد اکسیژن به مقدار زیاد، در کبدی که دچار ایسکمی-بازخونرسانی شده، منجر به آسیب می­شود که روندی اجتناب­ناپذیر در تروما، عفونت، پیوند کبد و یا بستن ساقه کبدی در طی اعمال جراحی می­باشد (El-Abhar et al., 2003). در بسیاری از مطالعات نشان داده شده است که استفاده از زداینده­های رایکال­های آزاد در کاهش شدت آسیب بافت کبد ناشی از ایسکمی-بازخونرسانی مفید واقع می­شود (Hassan-Khabbar et al., 2008; Polat et al., 2008).

   در برخی از مطالعات برای کاهش آسیب ایسکمی-بازخونرسانی، عوامل آنتی­اکسیدان فقط قبل از ایسکمی یا قبل از بازخونرسانی تجویز شده است و در برخی دیگر، هم قبل از ایسکمی و هم قبل از بازخونرسانی تجویز شده است (Sener et al., 2003). کروسین که به­عنوان یک آنتی­اکسیدان قوی شناخته شده است، به­صورت یک زداینده رادیکال آزاد عمل می­کند (Hosseinzadeh et al., 2005). در مطالعه حاضر کروسین قبل از القاء ایسکمی تجویز شده است. در این مطالعه تیمار با کروسین به طور مشخصی فعالیت آنزیم­های آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینو ترانسفراز و لاکتات دهیدروژناز را که در ارتباط با آسیب پارانشیم کبد هستند، کاهش داد. افزایش فعالیت آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینو ترانسفراز و لاکتات دهیدروژناز در گروه ایسکمی-بازخونرسانی می­تواند با پراکسیداسیون لیپیدی در اثر رادیکال­های آزاد اکسیژن تولید شده در مرحله بازخونرسانی که منجر به سیتولیز می­شود، توجیه گردد (Chouker et al., 2005). کاهش فعالیت آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینو­ترانسفراز و لاکتات دهیدروژناز در موش­های صحرایی تیمار شده با کروسین در مقایسه با گروه ایسکمی-بازخونرسانی، اثرات محافظتی محتمل کروسین را در کبدی که در معرض آسیب ایسکمی-بازخونرسانی واقع شده، نشان می­دهد. این اثر احتمالاً به دلیل محافظت غشاء سلول و ممانعت از نشت آنزیم‌های داخل آن حاصل می­گردد (Thabrew et al., 1987). متعاقب پیش­درمانی موش­های گروه ایسکمی-بازخونرسانی با کروسین، فقط تغییرات خفیف دژنراتیو سلول­های کبدی مشاهده گردید و اثری از نکروز دیده نشد که این خود اثرات حفاظتی کروسین را در این میان نشان می‌دهد. اثرات مفید فوق را می­توان به خواص آنتی­اکسیدانی کروسین و کاهش استرس­های اکسیداتیو مربوط دانست. به این معنا که، عصاره با جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدی منجر به تثبیت غشاء­های سلولی شده و مانع از نشت آنزیم­ها می­گردد. استرس اکسیداتیو مکانیسم­هایی را که به تولید سیتوکائین­های پیش­التهابی و مولکول­های الصاق سلولی منجر می­شوند، فعال می­کند. بنابراین، استرس اکسیداتیو ممکن است به یک پاسخ آماسی ناشی از آندوتوکسمی، بعد از ایسکمی-بازخونرسانی کبد منجر شود. یافته­های ما در توافق با مطالعات پیشین (Yildiz et al., 2008) تائید می­کند که ایسکمی-بازخونرسانی کبد استرس اکسیداتیو را به عنوان تاثیری که نه فقط باعث آسیب مستقیم بافت می­شود، بلکه تولید سیتوکائین­های توکسیک را که منجر به آماس و ارتشاح لکوسیت­ها می­شود، افزایش می­دهد.

در مطالعه ما افزایش میزان مالون­دی­آلدئید در کبد دچار ایسکمی-بازخونرسانی، نشان­ می­دهد که استرس­ اکسیداتیو ناشی از رادیکال­های آزاد، یکی از مکانیسم‌های محتمل در پاتوژنز آسیب ایسکمی-بازخونرسانی می­باشد. تحقیقات  گدیک و همکاران در سال 2008 نشان داده است که پراکسیداسیون لیپیدی متعاقب ایسکمی-بازخونرسانی در بافت کبد موش­های صحرایی اتفاق می­افتد که این یافته با نتایج مطالعه ما همخوانی دارد (Gedik et al., 2008).

   کاهش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز، به­عنوان یکی از مهم­ترین عوامل در سیستم تدافعی آنتی­اکسیدانی آنزیمی، شاخصی حساس برای آسیب سلول­های کبدی است. سوپراکسید دیسموتاز آنیون سوپراکسید را از طریق تبدیل آن به پراکسید هیدروژن پاک­سازی کرده و بدین ترتیب اثرات توکسیک آن را کاهش می­دهد (Curtis et al., 1972). در بررسی حاضر، میزان سوپراکسید دیسموتاز در موش­های صحرایی دچار ایسکمی-بازخونرسانی به دلیل تشکیل فراوان آنیون­های سوپراکسید، به­طور معنی­داری کاهش یافت که متعاقب آن فعالیت آنزیم­های زداینده پراکسید هیدروژن یعنی کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز نیز در این موش­های صحرایی به طور معنی­داری کاهش پیدا کرد. به نظر می­رسد که غیرفعال شدن سوپراکسید دیسموتاز توسط آنیون­های افزایش یافته سوپراکسید، منجر به غیرفعال شدن آنزیم­های کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز می­شود. کاتالاز با تجزیه پراکسید هیدروژن بافت­ها را در مقابل رادیکال­های بسیار فعال هیدروکسیل محافظت می­کند. بنابراین، کاهش فعالیت کاتالاز ممکن است به برخی اثرات مخرب ناشی از رادیکال سوپراکسید و پراکسید هیدروژن منجر گردد (Chance et al., 1952). گلوتاتیون ردوکتاز به­عنوان یک آنزیم سیتوزولی کبدی، در کاهش گلوتاتیون اکسید، به عنوان محصول نهایی فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز روی گلوتاتیون احیاء دخالت دارد (Naik and Panda, 2008).

   در مطالعه ما، مصرف کروسین مانع از کاهش سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز در اثر ایسکمی-بازخونرسانی شد که این پدیده ممکن است در اثر زدایش رادیکال­ها توسط کروسین اتفاق افتاده باشد که باعث حفظ و بقاء این آنزیم­ها شده است.  همچنین، متعاقب ایسکمی-بازخونرسانی کاهش قابل توجهی در میزان گلوتاتیون پراکسیداز حاصل گردید که منجر به دسترسی گلوتاتیون ردوکتاز به سوبسترا شده و بدین ترتیب فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز کاهش یافت. به نظر می­رسد که پیش­درمانی کروسین در آسیب ایسکمی-بازخونرسانی فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز را مجدداً برقرار نموده که مصرف گلوتاتیون اکسید را جهت تشکیل گلوتاتیون احیاء و افزایش سم­زدایی متابولیت­های فعال توسط کونژوگاسیون با گلوتاتیون احیاء برقرار می­کند. نتایج بررسی حاضر، گزارش سایر محققین را در خصوص اثرات آنتی­اکسیدانی و زدایش رادیکال­های آزاد توسط کروسین مورد تائید قرار می­دهد (Hosseinzadeh et al., 2009).

   تحقیقاتی که توسط حسین­زاده و همکارانش در سال 2005 در مورد اثرات محافظتی کروسین در برابر آسیب ایسکمی-بازخونرسانی کلیه انجام شده، نشان داده است که کروسین از طریق کاهش استرس­های اکسیداتیو نقش حفاظتی خود را در برابر آسیب ایسکمی-بازخونرسانی اعمال می­دارد به طوری­که، میزان پراکسیداسیون لیپیدی را کاهش و فعالیت آنزیم‌های سیستم تدافعی آنتی­اکسیدانی  را افزایش می­دهد (Hosseinzadeh et al., 2005). مکانیسم عملکرد کروسین در مطالعه ایشان با نتایج بررسی حاضر همخوانی دارد. مطالعات انجام شده توسط حسین­زاده و همکارانش در سال 2009 نشان داده است که تیمار با کروسین از بروز آسیب در سلول­های عضلانی واقع شده در معرض  ایسکمی-بازخونرسانی نیز ممانعت می­کند. طبق نظر ایشان اثر محافظتی کروسین به دلیل خواص آنتی­اکسیدانی آن بوده است (Hosseinzadeh et al., 2009).

   با توجه به مطالب مذکور، کروسین احتمالاً با خواص آنتی­اکسیدانی خود، کبد موش­های صحرایی را در برابر استرس اکسیداتیو ایسکمی-بازخونرسانی محافظت می­کند. بنابراین، پس از انجام کارآزمایی‌های بالینی و کسب نتایج مثبت، کروسین می‌تواند به‌عنوان یک داروی موثر جهت پیش­گیری از آسیب­های اکسیداتیو ایسکمی-بازخونرسانی در موارد تروما، عفونت، پیوند کبد و یا بستن ساقه کبدی در طی اعمال جراحی کبد مورد استفاده قرار گیرد. لکن، چگونگی تاثیر دزهای مختلف کروسین، مکان و مکانیسم یا مکانیسم‌های مولکولی و سلولی مؤثر در عملکرد فارماکولوژیکی آن ناشناخته مانده و نیاز به مطالعات آتی و گسترده­تری دارد.

  • Ahmad, A.S., Ansari, M.A., Ahmad, M., Saleem, S., Yousuf, S., Hoda, M.N., et al. (2005). Neuroprotection by crocetin in a hemi-parkinsonian rat model. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 81(4): 805-813.
  • Barber, D.A. and Harris, S.R. (1994). Oxygen free radicals and antioxidants: a review. Journal of American Pharmacists Association, NS34: 26-35.
  • Chance, B., Greenstein, D.S. and Roughton, R.J.W. (1952). The mechanism of catalase action. 1. Steady-state analysis. Archives of Biochemistry and Biophysics, 37(2): 301-321.
  • Chen, Y.,  Zhang, H.,   Tiana, X.,  Zhao, C.,  Cai, L.,  Liu, Y., et al. (2008). Antioxidant potential of crocins and ethanol extracts of Gardenia jasminoides ELLIS and Crocus sativus L.: A relationship investigation between antioxidant activity and crocin contents. Food Chemistry, 109(3):484-492.
  • Chouker, A., Martignoni, A., Schauer, R.J., Dugas, M., Schachtner, T., Kaufmann, I., et al. (2005). Alpha-gluthathione S-transferase as an early marker of hepatic ischemia/reperfusion injury after liver resection. World Journal of Surgery, 29: 528-534.
  • Claiborne, A. (1985). Catalase activity In: CRC Handbook of methods for oxygen radical research. Boca Raton, F.L. editor. Florida: CRC Press, Boca Raton, 99: 283-284.
  • Curtis, S.J., Mortiz, M. and Sondgrass, P.J. (1972). Serum enzymes derived from liver cell fractions. I. The response to carbon tetrachloride intoxication in rats. Gastroentrology, 62(1): 84-92.
  • Das, D.K. and Maulik, N. (1994). Antioxidant effectiveness in ischemia–reperfusion tissue injury. Methods in Enzymology, 233: 601-610.
  • El-Abhar, H.S., Abdallah, D.M. and Saleh S. (2003). Gastroprotective activity of Nigella sativa oil and its constituent, thymo-quinone, against gastric mucosal injury induced by ischaemia/reperfusion in rats. Journal of Ethnopharmacology, 84: 251-258.
  • Fraga, C.G., Leibovitz, B.E. and Tappel, A.L. (1988). Lipid peroxidation measured as thiobarbituric acid-reactive substances in tissue slices: characterization and comparison with homogenates and microsomes. Free Radical Biology and Medicine, 4(3): 155-161.
  • Frei, A., Zimmermann, A. and Weigand, K. (1984). The N-terminal propeptide of collagen type III in serum reflects activity and degree of fibrosis in patients with chronic liver disease. Hepatology, 4(5): 830-834.
  • Gedik, E., Girgin, S., Ozturk, H., Obay, B.D., Ozturk, H. and Buyukbayram, H. (2008). Resveratrol attenuates oxidative stress and histological alterations induced by liver ischemia/reperfusion in rats. World Journal of Gastroenterology, 14(46): 7101-7106.
  • Hassan-Khabbar, S., Cottart, C.H., Wendum, D., Vibert, F., Clot, J.P., Savouret, J.F., et al. (2008).  Postischemic treatment by trans-resveratrol in rat liver ischemia-reperfusion: a possible strategy in liver surgery. Liver Transplantation, 14:451-459.
  • He, X.S., Ma, Y., Wu, L.W., Wu, J.L., Hu, R.D., Chen, G.H., et al. (2005). Dynamical changing patterns of glycogen and enzyme histochemical activities in rat liver graft undergoing warm ischemia injury. World Journal of Gastroenterology, 11: 2662-2665.
  • Hosseinzadeh, H., Modaghegh, M.H. and Saffari, Z. (2009). Crocus Sativus L. (Saffron) Extract and its Active Constituents (Crocin and Safranal) on Ischemia-Reperfusion in Rat Skeletal Muscle. Evidence- Based Complementary and Alternative Medicine, 6(3): 343-350.
  • Hosseinzadeh, H., Sadeghnia, H.R., Ziaee, T. and Danaee, A. (2005). Protective effect of aqueous saffron extract (Crocus sativus L.) and crocin, its active constituent, on renal ischemia-reperfusion-induced oxidative damage in rats. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical sciences, 8(3): 387-393.
  • Lee, G. and Luna, H.T. (1988). Manual of histologic staining methods of the armed forces institute of pathology. 3rd ed., The Blakiston Division Mc Graw. Hill Book Company, pp: 32-107.
  • Magesh, V., Singh, J.P., Selvendiran, K., Ekambaram, G. and Sakthisekaran, D. (2006). Antitumour activity of crocetin in accordance to tumor incidence, antioxidant status, drug metabolizing enzymes and histopathological studies. Molecular and Cellular Biochemistry, 287(1-2): 127-135.
  • Martinek, R.G. (1972). A rapid ultraviolet spectrophotometric lactic dehydrogenase assay. Clinica Chimica Acta,40(1): 91-99.
  • Mohandas, J., Marshal, J.J., Duggin, G.G., Horvath, J.S. and Tiller, D.G. (1984). Low activities of glutathione-related enzymes as factors in the genesis of urinary bladder cancer. Cancer Research, 44(11): 5086-5091.
  • Montalvo-Jave, E.E., Escalante-Tattersfield, T., Ortega-Salgado, J.A., Pina, E. and Geller, D.A. (2008). Factors in the pathophysiology of the liver ischemia-reperfusion injury. Journal of Surgical Research, 147: 153-159.
  • Naik, S.R. and Panda, V.S. (2008). Hepatoprotective effect of Ginkgoselect Phytosome® in rifampicin induced liver injurym in rats: Evidence of antioxidant activity. Fitoterapia, 79(6): 439-445.
  • Nishikimi, M., Appaji, N. and Yagi, K. (1972). The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen. Biochemical and Biophysical Research Communications, 46(2): 849-854.
  • Polat, K.Y., Aydinli, B., Polat, O., Aydin, U., Yazici, P., Ozturk, G., et al. (2008). The protective effect of aprotinin and alpha-tocopherol on ischemia-reperfusion injury of the rat liver. Transplantation Proceedings, 40: 63-68.
  • Pulitano, C. and Aldrighetti, L. (2008). The protective role of steroids in ischemia-reperfusion injury of the liver. Current Pharmaceutical Design, 14: 496-503.
  • Reitman, S. and Frankel, S. (1957). A colorimetric method for the determination of serum glutamic oxaloacetic and glutamic pyruvic transaminase. American Journal of Clinical Pathology, 28: 56-63.
  • Rotruck, I.T., Pope, A.L., Ganther, H.E., Swanson, A.B., Hafeman, D.G. and Hoekstra. W.G. (1973). Selenium: Biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science, 179: 588-590.
  • Sanchez-Moreno, C., Larrauri, J.A. and Saura-Calixto, F. (1999). Free radical scavenging capacity and inhibition of lipid oxidation of wines, grape juices and related polyphenolic constituents. Food Research International, 32: 407-412.
  • Sener, G., Tosun, O., Sehirli, A.O., Kacmaz, A., Arbak, S., Ersoy, Y., et al. (2003). Melatonin and N-acetylcysteine have beneficial effects during hepatic ischemia and reperfusion. Life Science, 72: 2707-2718.
  • Shen, S.Q., Zhang, Y., Xiang, J.J. and Xiong, C.L. (2007). Protective effect of curcumin against liver warm ischemia/reperfusion injury in rat model is associated with regulation of heat shock protein and antioxidant enzymes. World Journal of Gastroenterology, 13: 1953-1961.
  • Shin, T., Kuboki, S., Huber, N., Eismann, T., Galloway, E., Schuster, R., et al. (2008). Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma during hepatic ischemia is age-dependent. Journal of Surgical Research, 147: 200-205.
  • Thabrew, M.I., Joice, P.D. and Rajatissa, W. (1987). A comparative study of the efficacy of Pavetta indica and Osbeckia octanda in the treatment of liver dysfunction. Planta Medica, 53(3):239-41.
  • Tseng, T.H., Chu, C.Y., Huang, J.M., Shiow, S.J. and Wang, C.J. (1995). Crocetin protects against oxidative damage in rat primary hepatocytes. Cancer Letters, 97(1): 61-67.
  • van Gulik, T.M., de Graaf, W., Dinant, S., Busch, O.R. and Gouma, D.J. (2007). Vascular occlusion techniques during liver resection. Digestive Surgery, 2007, 24: 274-281.
  • Xiang, M., Qian, Z.Y., Zhou, C.H., Liu, J. and Li, W.N. (2006). Crocetin inhibits leukocyte adherence to vascular endothelial cells induced by AGEs. Journal of Ethnopharmacololgy, 107(1): 25-31.
  • Yildiz, F., Coban, S., Terzi, A., Ates, M., Aksoy, N., Cakir, H., et al. (2008).Nigella sativa relieves the deleterious effects of ischemia reperfusion injury on liver. World Journal of Gastroenterology, 14(33): 5204-5209.
  • Yildiz, F., Coban, S., Terzi, A., Ates, M., Aksoy, N., Cakir, H., et al. (2008).Nigella sativa relieves the deleterious effects of ischemia reperfusion injury on liver. World Journal of Gastroenterology, 14(33): 5204-5209.
  • Zheng, Y.Q., Liu, J.X., Wang, J.N. and Xu, L. (2007). Effects of crocin on reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to cerebral microvessels after global cerebral ischemia. Brain Research, 1138: 86-94.