مطالعه اثر مهارکننده های آروماتاز و آنتی استروژن ها بر تمایز جنسیت جوجه های گوشتی

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

1 گروه بیوشیمی، دانشگاه پیام نور، شبستر، شبستر، ایران

2 گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاداسلامی، واحد تبریز، تبریز، ایران

چکیده

در طول تکوین جنین جوجه، ژنوتیپ تخم ماهیت غده­های جنسی را تعیین می­کند که پس از آن فنوتیپ نر یا ماده ایجاد می­شود. تمایز غده­های جنسی، در دوره­ای بنام "دوره بحرانی تمایز جنسیت" همزمان با شروع ترشح هورمون­های استروئیدی جنسی صورت می­گیرد. هرگونه تغییری در میزان غلظت هورمون­های استروئیدی در دوره بحرانی، بر ساختار غدد جنسی اثر می­گذارد. بر این اساس تزریق مهار کننده­های آروماتاز (که سنتز استروژن از تستوسترون را بلوکه می­کند) در روز پنجم انکوباسیون به داخل تخم­ها سبب ایجاد نرهایی با ژنوتیپ ماده می­شود که این ماده­های جنس برگشته دارای بیضه­های دو طرفی هستند که توانایی کامل اسپرماتوژنز و تظاهرات فیزیکی و رفتارهای طبیعی را دارند. در این مطالعه مهارکننده 14-آلفا-هیدروکسی-3 و 6 و 17 آندرواستن-تریون با دوز 1 میلی­گرم در هر تخم تزریق شد. علاوه بر این، تأثیر سه آنتی استروژن (که رسپتورهای استروژن را بلوکه می­کنند) به نام­های تاموکسیفن و کلومیفن سیترات و GAR79 نیز مورد بررسی قرار گرفت. تزریق آنتی آروماتاز به­داخل تخم مرغ در دوره آنکوباسیون در 72% تا 84% موارد موجب تولید جنس نر می­گردد که در مقایسه با شاهد (5/52%) افزایش معنی­داری را نشان داد(05/0>p). نتایج این مطالعه نشان می­دهد که آنتی آروماتاز بر جنس جوجه­ها تأثیر می­گذارد. 

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Study on the effect of aromatase inhibitors and antiestrogens on the sex differentiation of broiler chicks

نویسندگان [English]

  • E.A Valizadeh 1
  • H Jodeiri 2
1 Department of Biochemistry, Payam-e-nour University, Shabestar, Iran
2 Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Tabriz Branch, Islamic Azad Universit, Tabriz, Iran
چکیده [English]

During the development of chick embryo, the genotype of the zygote determines the nature of the gonads, which thereafter creates the male or female phenotype. Differentiation of gonads during the period called “critical period for sexual differentiation “is accompanied with beginning of secretion of sexual hormones. Every change in the rate of steroidal hormones concentration during this critical period, affects on the structure of gonads. Therefore, injection of aromatase inhibitors (which blocks the synthesis of estrogen from testostron) in 5th day of incubation into the eggs, causes the production of males with female genotype. These sex reversal females have bilateral testes with complete spermatogenesis, having normal physical appearance and behavior. In this study, 14-α-hydroxy 3,6,17, androstan-trion inhibitor (1mg/egg) was injected into the eggs. Furthermore, the effect of three anti-estrogens (which blocks the estrogen receptor) Tamoxifen, and Clomiphen Citrate and GAR79 were studied. Injection of aromatase inhibitors into the eggs during incubation period caused statistically significant (p<0.05) increase in production of males (%72 to %84) in comparison with control (%52/5 male). The results of this study showed that aromatase inhibitors affects on the sex differentiation of broiler chicks.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Aromatase inhibitors
  • Antiestrogen
  • Sex differentiation
  • chick

     تمایز جنسیت یک فرایند منظم و متوالی است. ژنوتیپ تخم ماهیت غدد جنسی را تعیین می­کند که منجر به تکامل فنوتیپ نر یا ماده می­شود (1). در پستانداران، کروموزوم Y و تکامل یک بیضه از گناد تمایز نیافته نقش اساسی دارد. تکامل بیضه­ها و تمایز جنسیت بیشتر وابسته به تنظیم­های هورمونی از دو طریق AMH (Anti- Mullerian Hormone) و آندروژن ترشح شده از بیضه­ها است (2). AMH از سلول­های سرتولی ترشح شده و با تحلیل مجرای مولر از تکوین دستگاه تولید مثل ماده جلوگیری می­کند (3). سطح هورمون­های استروئیدی به­وسیله مهار آنزیم آروماتاز تنظیم می شود  که این آنزیم آخرین مرحله از مسیر بیوسنتز استروئیدهای جنسی را کاتالیز و آندروژن­ها را به استروژن­ها تبدیل می­کند (1). در روی کروموزوم Y قبل از انتهای اتوزومی کاذب یک ناحیه 35 کیلو جفت باز قرار دارد که یک پپتید 233 اسید آمینه را کد می­کند. این ناحیه را ژن SRY (Sex-determining Region of Y) یا ناحیه تعیین کننده جنسیت کروموزوم Y می نامند (4). ژن­های دیگری بنام SOX شناسایی شده است که پروتئین­هایی را کد می­کنند که  با ناحیه SRY HMG box بیش از 60% تشابه دارد و SOX9 نقش مهمی در تعیین جنسیت دارد (5). پرندگان ماده به­صورت هتروگامت (ZW) بوده، در حالی­که نر به­صورت هموگامت (ZZ) می باشد. از نظر شباهت با کروموزوم Y، کروموزوم W در تعیین جنسیت پرندگان ایفای نقش می­کند. در  پرندگان، استروئیدهای جنسی و همچنین هورمون آنتی مولارین به­طور طبیعی در تمایز جنسیت دخالت داشته و آندروژن و استروژن به ترتیب روی تولید نر و ماده مؤثر هستند. آنزیم P450 آروماتاز (P450 arom) یک آنزیم کلیدی در تبدیل استروژن شناخته شده و در جوجه­های مادهP450 arom mRNA  نسبت بهmRNA  AMH نرها زودتر بیان می­شود. بنابراین بیان ژن P450 arom به عنوان یک پروسه مهم در ابتدای مسیر تمایزی ماده بوده و نکته مهم­تر اینکه فرآیند مذکور مستقیمأ با مکانیسم­های ژنتیکی تعیین جنسیت در ارتباط است (6).

مطالعات ایمنوسیتوشیمیایی نشان داده است که جنسیت به تولید متفاوت آندروژن و استروژن بعد از روز 5/6 انکوباسیون بستگی دارد که در گنادهای نر نسبت به گنادهای ماده آندروژن بیشتری تولید و استروژن در گنادهای ماده نسبت به گنادهای نر بیشتر تولید می­گردد (7). جنین جوجه­های هر دو جنس توانایی سنتز آندروژن را دارند در حالی­که جنین­های با ژنوتیپ ماده قادر به تولید استروژن، جدای از آندروژن در مدت کوتاهی قبل از تمایز جنسیت گنادها است. بنابراین در جنین جوجه ماده بیان P450 arom mRNA  نقش اساسی در مراحل اولیه تولید استروژن دارد.

هدف از انجام این مطالعه بررسی اثرات مهار کننده استرادیولی آروماتاز 14-آلفا-هیدروکسی-3 و 6 و 17-آندرواستن-تریون و نیز سه آنتی استروژن به نام­های تاموکسیفن، کلومیفن سیترات و GAR78 روی تعیین جنسیت جوجه­های گوشتی آرین بود.

مواد و روش­ها

     در این بررسی از تخم مرغ­های تولید شده از مرغ­های نژاد Arian استفاده شد. تخم­ها به 5 گروه 60 تایی تقسیم و در داخل دستگاه تمام اتوماتیک جوجه­کشی قرار گرفتند. کلیه آزمایشات در شرکت دامپروری سفید رود رشت صورت گرفته است. در صبح روز پنجم انکوباسیون به گروه اول 1/0
میلی­لیتر آب مقطر، به گروه دوم یک میلی­گرم AI (اهدایی پروفسور Makoto Yoshihama از انستیتو تحقیقات استراتژیک ژاپن)، به گروه سوم یک میلی­گرم تاموکسیفن حل شده در آب، به گروه چهارم یک میلی­گرم کلومیفن سیترات حل شده در آب و به گروه پنجم یک میلی­گرم GAR79 (ترکیب استخراجی که به­صورت تحقیقات اولیه در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفت) تزریق شد. تزریق از ناحیه سر کوچک تخم مرغ (مقابل کیسه هوا) با سرنگ انسولین 5/0 میلی لیتر به­داخل سفیده تخم مرغ انجام شد. سپس به کمک پیپت پاستور سوراخ تخم­ها را با پارافین جامد مذاب شده مسدود و تخم­ها  به داخل دستگاه برگردانده شد. جوجه­ها پس از هچ شدن در یک روزگی به روش Feather Sexing تعیین جنسیت شدند. در عین حال به منظور اطمینان کار، جوجه­ها به مدت 45 روز پرورش و مجدداً تعیین جنسیت داده شد. نتایج به­وسیله آزمون خی دو ارزیابی شدند. 05/0p< معنی­دار تلقی شد.

یافته­ها

      نتایج به­دست آمده در جدول 1 نشان داده شده است. در هر چهار گروه آزمایشی تغییر معنی­داری در تعداد جنس­های نر تولیدی مشاهده گردید. اگرچه تاموکسیفن و کلومیفن دارای اثرات منفی در میزان هچ تخم مرغ­ها  داشت و تیمار با این دو آنتی استروژن­ علاوه بر تأثیر منفی بر هچ شدن جوجه،
جوجه­های هچ شده نیز دارای آسیب­های جدی بوده و بعد از هچ شدن تعدادی تلف شدند. مشاهدات ماکروسکوپی
اندام­های تناسلی نشان داد که در برخی از موارد تخم­دانها تحلیل رفته و کوچکتر شده­اند. در برخی دیگر حالت بینابینی وجود دارد. ضمناً موارد ناهنجاری خاصی که بتوان به تیمارها نسبت داد، در بین جوجه­ها مشاهده نشد. یعنی اینکه تزریق این مواد فقط تعادل هورمون­های استروئیدی جنسی را در زمان تمایز جنسیت تغییر می­دهد.

 

جدول 1- مقایسه اثرات آنتی آروماتازهای مختلف روی درصد تولید جوجه­های نر و ماده

 

ماده

نر

درصد نر

درصد ماده

آب مقطر

18

20

5/52

5/47

AI

6

30

83

17

تاموکسیفن

4

21

84

16

کلومیفن

2

11

84

16

GAR79

8

21

72

28

 

 

 

 

 

 

 

 

نتایج آزمون خی دو نشان­دهنده تأثیر معنی­دار آنتی آروماتازها بر ازدیاد تولید جوجه­های نر (05/0p<). می­توان دید که متغیر مورد بررسی جوجه نر تأثیر دارد.

 نتایج اولیه حاصل از اثرات GAR78 استخراج (که به عنوان ماده گیاهی استخراجی (فیتواستروژنی) در این پژوهش مورد استفاده قرار گرفت) نشان داده که در صورت بهینه کردن مقدار تزریق و تکمیل فرآیند استخراج می­تواند به عنوان یک فیتوستروژن مورد استفاده قرار گیرد.

بحث و نتیجه­گیری  

    از آنجا که تمایز جنسیت جوجه در روز 5/6 انکوباسیون صورت می­گیرد، هرگونه تغییر در غلظت هورمون­های جنسی در این مرحله منجر به تغییرات در ساختار بافت غدد جنسی می­شود (2). AIبا بلوکه کردن فعالیت آروماتاز سبب افزایش آندروژن­ها و به­طور همزمان کاهش غلظت استروژن­ها می­شود (1) و آنتی استروژن­ها با بلوکه کردن رسپتور استروژن از ظاهر شدن اثر استروژن جلوگیری می­کنند. بدین ترتیب نسبت آندروژن به استروژن تغییر می­کند و تمایز جنسیت به سمت نر شدن پیش می­رود (8). این مطالعه وابستگی تمایز جنسیت به هورمون­های جنسی را نشان می­دهد. تزریق استرادیول بنزوات و یا مهار کننده آروماتاز هیچ تأثیری روی شرایط عمومی جنین­ها ندارد. اساس هورمونی تمایز جنسیت در حساسیت به استروژن ناشناخته است (8). تنظیم آروماتاز ممکن است در تمایز جنسیت گونه­های دیگر نیز سهیم باشد، مثلاً در جنین انسان ماده در صورت نقص فعالیت آنزیم آروماتاز جنینی، هرمافرودیسم کاذب اتفاق می­افتد (9) نتایج این تحقیق دلالت بر نقش فعالیت آروماتاز در کنترل تمایز و تعیین جنسیت دارد. نتایج بررسی حاضر با نتایج حاصل از مطالعات انجام شده روی سایر گونه­های حیوانی در توافق می­باشد (1، 2 و 3).

  1. Smith, R.G. and Elbrecht, A. 1992. Aromatase enzyme activity and sex determination in chickens. Science. 255: 467-70
  2. Shimada, K. and Saito, N .2000. Molecular mechanisms of sex determination and sex differentiation. Japanese Poultry Science. 37:3-11
  3. Wibbels, T. 1992. Steroid hormone–induced male sex determination is anaminiotic vertebrate. J Exp Zool. 262:454 
  4. Sincair, A.H. 1990. Agene from the human sex-determining region encodes a protein with homology to a conserved DNA-binding motif. Nature. 346:240-244.
  5. Kwok, C. 1995. Mutations in sox9, the gene responsible for compomelic dysplasia and autosomal sex reversal. Am. J. Hum. Genet. 57:1028-1036
  6. Shimada, K. 1998. Gene expression of steroidogenic Enzymes in chicken embryonic gonads. J. Exp. Zool. 281:450-6
  7. Smith, C.A. 1997. Gondadelsen differentiation in chicken embryos. Expression of estrogen receptor and aromatase gens. J. Steroid Bichem. Mol. Biol. 60:295-302.
  8. Baltazartj, E.A. 1992. Behavioral Demasculinization of Female quails induced by estrogens: Studies with new Aromatase inhibitor, R76713 Hormones and Behavior. 26:179-203.
  9. Shozu, M, and Haradat, K. 1991.  J. Clin. Endocrinol. Metal. 27: 560-4.