بررسی اثرات آنتی‌اکسیدانی عصاره چای سبز در برابر سمیّت کبدی ایزونیازید در موش صحرایی

نوع مقاله: علمی پژوهشی

چکیده

بیماری سلّ هم چنان به عنوان یک مسئله بهداشت عمومی در سراسر جهان مطرح است. ایزونیازید که به عنوان یک آنتی­بیوتیک به طور معمول برای درمان بیماری سلّ مورد استفاده قرار می­گیرد، یک عامل توکسیک قوی برای کبد به شمار می­رود. هدف از این مطالعه، ارزیابی اثرات آنتی اکسیدانی عصاره چای سبز در مقابل سمیّت کبدی ایزونیازید در موش صحرایی می­باشد. موش­های صحرایی نر ویستار به طور تصادفی در موش‌ها به‌طور تصادفی به 4  گروه 10 سری شامل: 1-گروه شاهد سالم 2- گروه سالم تیمار با عصاره 3-گروه داروی سمی و 4- گروه تیمار با عصاره و داروی سمی تقسیم شدند. از زمان شروع آزمایش تا پایان 8 هفته در گروه­های 2 و 4  از محلول عصاره 5/1% برای نوشیدن استفاده شد. در اواسط دوره آزمایش (هفته­های چهارم و پنجم آزمایش) به گروه­های 3 و 4 داروی ایزونیازید روزانه و به­میزان mg/kg50 به­صورت داخل صفاقی تزریق گردید. در پایان دوره آزمایش، ماحصل پراکسیداسیون لیپیدی (مالون دی آلدئید)، فعالیت سوپراکسید دسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز جهت ارزیابی استرس اکسیداتیو در هموژنات بافت کبد مورد سنجش قرار گرفت. گروه­ها توسط آزمون آماری‏ آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تعقیبی توکی با هم مقایسه گردیدند. سطح معنی­داری 05/0p< در نظر گرفته شد. عصاره چای سبز به طور معنی­داری میزان پراکسیداسیون لیپیدی را کاهش و سطوح آنتی اکسیدان­ها را در موش­های تیمار شده با ایزونیازید افزایش داد. بررسی حاضر نشان داد که اثرات محافظتی عصاره چای سبز در آسیب اکسیداتیو کبدی ناشی از ایزونیازید، ممکن است با خواص آنتی‌اکسیدانی و زدایندگی رادیکال‌ آزاد آن مرتبط باشد. 

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Antioxidant activity of Green tea extract against Isoniazid induced hepatotoxicity in the rats

چکیده [English]

Tuberculosis continues to be a common health problem worldwide. Isoniazid, an antibiotic used routinely for tuberculosis chemotherapy is documented to be a potent hepatotoxicant. The aim of the present study was to assess the antioxidant activity of Green tea extract (GTE) against Isoniazid induced hepatotoxicity in the rats. Male Wistar rats were randomly assigned into 4 groups of 10 animals each including 1- normal healthy control rats, 2- healthy rats receiving (GTE) 3- toxicant control, and 4- toxicant drug+ GTE treatment group. In groups 2 and 4 GTE (1.5%, w/v) was given as only source of drinking for 8 weeks. In the midst stage of experiment (4th and 5th weeks), Isonizid (50 mg/kg b.w./day, i.p.) was administrated for groups 3 and 4 for a period of 2 weeks. At the end of experiment, product of lipid peroxidation (MDA), activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPX) and glutathione reductase (GR) were assayed in liver homogenates to evaluate antioxidant activity. Significant differences among the groups were determined by one-way analysis of variance followed by Tukey post-test. Statistical significance was considered at p<0.05. In Isoniazid-treated rats, GTE (1.5%, w/v) significantly decreased the lipid peroxidation and elevated the levels of antioxidant enzymes. This study showed that the hepatoprotective effect of GTE in Isoniazd-induced oxidative damage may be related to its antioxidant and free radical scavenging activity.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Green tea extract
  • Isoniazid
  • Hepatotoxicity
  • Antioxidant
  • Rats

مقدمه

 

     بیماری سلّ همچنان به‌عنوان یک مسئله بهداشت عمومی در سراسر جهان مطرح می‌باشد، به‌خصوص اینکه با شیوع بیماری ایدز یکی از عوامل عمده منجر به فوت در مبتلایان بزرگسال می‌باشد (10). ایزونیازید (Isoniazid) که به‌عنوان یک داروی مؤثر به‌طور معمول برای درمان بیماری سل مورد استفاده قرار می‌گیرد، یک عامل توکسیک قوی برای کبد به شمار می‌رود. از آنجائی­که کبد مکان اصلی سم­زدایی داروی ضد سل ایزونیازید می­باشد، لذا تجویز آن اختلالات متعدد متابولیک و مورفولوژیک را در کبد ایجاد می­کند. این دارو توسط مکانیسم­های متعددی باعث بروز هپاتیت می­شود که با کاهش غلظت سرمی آلبومین و افزایش گلوبولین­های سرمی بسته به شدت و مدت بیماری، مشخص می­گردد. نشان داده شده است که پراکسیداسیون لیپیدهای آندوژن اصلی­ترین فاکتور در سیتوتوکسیسیتی ایزونیازید می­باشد. آسیب­های اکسیداتیو ناشی ایزونیازید به تشکیل گونه­های بسیار فعال اکسیژن که باعث پراکسیداسیون لیپیدی و تخریب و آسیب غشاء­های لیپیدی می­شوند، نسبت داده می­شود (11). تغییر در مکانیسم­های متعدد تدافعی سلول شامل اجزای آنزیماتیک و غیر آنزیماتیک (گلوتاتیون احیاء reduced glutathione; GSH.) در هپاتوتوکسیسیتی ناشی از ایزونیازید گزارش شده است (39).

استفاده از گیاهان دارویی جهت درمان طیف وسیعی از
بیماری­ها، به سرعت در حال توسعه می­باشد. توجه ویژه­ای به  اثرات محافظتی آنتی اکسیدان­های با منشاء طبیعی در برابر مسمومیت­های ناشی از عوامل شیمیایی شده است (9).  امروزه، چای به عنوان منبعی با فعالیت­های بیولوژیک و فارماکولوژیک مفید برای سلامتی انسان مورد توجه قرار گرفته است.  خواص درمانی عصاره چای و پلی­فنل­های کاتچینن (catechin polyphenols) آن، منجر به انجام بررسی­های علمی در جهت پیشگیری و درمان بیماری­های متعددی توسط این عصاره شده است  (21 و 28). Crespy و Williams در سال 2004 گزارش کرده­اند که عصاره چای سبز دارای خواص آنتی­اکسیدانی و زدایندگی رادیکال­های آزاد می­باشد (3). Mohamadin و همکاران در سال 2005 نشان دادند که
هم­آوری (supplementation) عصاره چای سبز، آسیب­های اکسیداتیو ناشی از سیکلوسپورین- A را کاهش می­دهد (23). مشخص شده است که کاتچین­های چای سبز از پراکسیداسیون لیپیدی توسط مواد شیمیایی در کبد و کلیه حیوانات جلوگیری می­کند (35). همچنین، تحقیقات نشان داده است که
پلی­فنل­های چای سبز، دارای خواص ضد سرطانی در انسان می­باشد (19 و 40).

با توجه به اثرات مفید و متعدد درمانی چای سبز، گمان می­رود این گیاه بتواند کبد را در مقابل اثرات اکسیداتیو توکسیک ایرونیازید محافظت کند. در هر صورت با توجه به  بررسی منابع، مطالعه‌ای در رابطه با اثرات محافظتی عصاره چای سبز در مقابل سمیّت کبدی ایرونیازید وجود ندارد. بنابراین تحقیق حاضر برای اولین بار جهت ارزیابی اثرات محافظتی عصاره چای سبز در مقابل سمیّت کبدی ایزونیازید طراحی گردیده است.

مواد و روش­ها

     مطالعه حاضر از نوع تجربی مداخله‌گر آزمایشگاهی می‌باشد. برای انجام این مطالعه،  از تعداد 100  سر موش صحرایی نر بالغ نژاد ویستار با وزن تقریبی 20200 گرم و در محدوده سنی 9 هفته استفاده شد. شرایط تغذیه و نگه­داری برای تمام گروه‌ها یکسان و به صورت 12 ساعت روشنایی/تاریکی و دمای 221 درجه سانتی‌گراد بود. جیره غذایی یکسان و آب نیز به‌طور آزاد در دسترس قرار گرفته و پس از یک هفته عادت به شرایط جدید، آزمایش شروع شد. موش‌ها به‌طور تصادفی به 4  گروه مساوی شامل: 1- گروه شاهد سالم 2- گروه سالم تیمار با عصاره 3-گروه داروی سمی (Toxicant Control) 4- گروه تیمار با عصاره و داروی سمی تقسیم شدند. عصاره طبق روش Maity و همکاران در سال 1998 تهیه گردید. به این صورت که 15 گرم پودر چای سبز تازه در یک لیتر آب مقطر جوشان به مدت 5 دقیقه خیسانده شده و محلول به دست آمده صاف و عصاره 5/1% تهیه شد. این محلول به عنوان تنها منبع آب نوشیدنی برای موش­های تیمار با عصاره، مورد استفاده قرار گرفت (20). آزمایش مدت 8 هفته به طول انجامید. از زمان شروع آزمایش تا پایان 8 هفته در گرو­های 1 (شاهد سالم) و 3 (گروه داروی سمی) صرفاً از آب مقطر و در گروه­های 2 (سالم تیمار با عصاره) و 4 (عصاره + داروی سمی) از محلول عصاره 5/1% برای نوشیدن استفاده شد. در اواسط دوره آزمایش (هفته­های چهارم و پنجم آزمایش) به گروه­های 3 و 4 داروی ایزونیازید روزانه و به­میزان mg/kg50 به شکل محلول در آب مقطر استریل (ml/kg 10) به­صورت داخل صفاقی تزریق گردید (31 و 38). به گروه­های 1 و 2 نیز به­طور همزمان فقط آب مقطر استریل به همان ترتیب تزریق شد.

در پایان دوره آزمایش (8 هفته) و 24 ساعت پس از آخرین تیمار، هم زمان همه موش­ها با ایجاد دررفتگی در مهره­های گردن راحت­کشی شدند. کبد موش­ها سریعاً خارج و در سالین بسیار سرد شستشو و هموژنات 10%  در 15/1% (w/v) کلرور پتاسیم تهیه‌ گردید. هموژنات با سرعت 7000 دور در دقیقه و به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد و محلول شناور جهت سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدی از طریق اندازه­گیری مقدار مالون‌دی‌آلدئید (Malondialdehyde) و همچنین برای اندازه­گیری فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی سوپراکسید دسموتاز (Superoxide dismutase)، کاتالاز (Catalase)، گلوتاتیون پرکسیداز (Glutathione peroxidase) و گلوتاتیون ردوکتاز (Glutathione reductase) مورد استفاده قرار گرفت.

الف) اندازه ‌گیری مقدار مالون­‌دی­‌آلدئید

مالون­دی­آلدئید، به عنوان مقیاسی از پراکسیداسیون چربی، در قالب TBARS (Thiobarbituric acid reacting substances) و با استفاده از روش Esterbauer و Cheesman مورد سنجش قرار گرفت (8). به طور خلاصه، مخلوط واکنشگری متشکل از 2/0 میلی‌لیتر لوریل سولفات سدیم 1/8 درصد، 5/1 میلی‌لیتر محلول اسید استیک 20 درصد با 5/3pH= و 5/1 میلی‌لیتر از محلول آبی 8/0 درصد تیوباربیتوریک اسید در 2/0 میلی لیتر PMS 10 درصد (w/v)، ایجاد گردید. حجم مخلوط به دست آمده، توسط آب مقطر به 4 میلی لیتر افزایش یافت، سپس به مدت 60 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد حرارت داده شد.

پس از خنک شدن در آب جاری، 1 میلی‌لیتر آب مقطر و 5 میلی‌لیتراز مخلوط n-بوتانول و پیریدین (v/v ،15:1) به آن افزوده سپس سانتریفیوژ گردید. لایه ارگانیک آن برداشته شد و شدت جذب در (nm) 532 نانومتر اندازه‌گیری گردید. میزان TBARS با استفاده از ضریب 1-cm 1-M105×56/1 اندازه‌گیری و به‌صورت نانومول TBARS در میلی‌گرم پروتئین بیان گردید. پروتئین بافتی با استفاده از روش بیوره اندازه گیری و مقدار TBARS به صورت نانومول در میلی‌گرم پروتئین بیان گردید.

ب) اندازه‌گیری فعالیت سوپراکسید دسموتاز

فعالیت سوپراکسید دسموتاز توسط روش Nishikimi (27) مورد سنجش و توسط روش Kakkar (17) نیز تعدیل گردید. در حدود 5 میکروگرم از پروتئین­های تام هر یک از
هموژنات­های کبدی با بافر پیروفسفات سدیم، PMT (Phenazine methosulfate) و NBT (Nitro-blue Terazolium) مخلوط گردید. واکنش با افزودن NADH (Nicotinamide-adenine dinucleotide) آغاز گردید. مخلوط واکنش در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 90 ثانیه انکوبه و با افزودن 1 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال متوقف گردید. شدت جذب مخلوط رنگزای تشکیل شده در nm560 اندازه­گیری گردید. هر واحد از فعالیت سوپراکسید دسموتاز به صورت غلظت آنزیم مورد نیاز برای ممانعت از تولید رنگ تا 50 درصد در 1 دقیقه، تحت شرایط مطالعه، تعیین گردید.

ج) اندازه گیری فعالیت کاتالاز

فعالیت کاتالاز توسط روش Claiborne (2) و براساس تجزیه پراکسید هیدروژن در nm240، مورد سنجش قرار گرفت. به طور خلاصه، مخلوط مورد سنجش متشکل از 95/1 میلی­لیتر بافرفسفات (7M, pH=  05/0)، 1 میلی­لیتر پرکسید هیدروژن (M 019/0) و 05/0 میلی­لیتر PMS (10%) در حجم نهایی 3 میلی‌لیتر بود. تغییرات در جذب در nm240 اندازه‌گیری گردید. در نهایت نتیجه به شکل "فعالیت کاتالاز در دقیقه" محاسبه گردید.

د) اندازه­گیری فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز

فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز با استفاده از روش Rotruck و همکاران (33) و بر اساس واکنش ذیل مورد سنجش قرار گرفت.

H2O2 + 2GSH (گلوتاتیون احیاء) → 2H2O + GSSG (گلوتاتیون اکسید)

گلوتاتیون پراکسیداز، در هموژنات بافتی، گلوتاتیون را اکسیده کرده که به طور همزمان پراکسید هیدروژن به آب احیاء
می­گردد. این واکنش پس از 10 دقیقه توسط تری‌کلرواستیک اسید متوقف و گلوتاتیون باقیمانده توسط محلول DTNB (Dithiobis nitrobenzoic acid) مجدداً فعال گردیده و منجر به تشکیل ترکیب رنگی می­گردد که با اسپکتروفتومتر در nm420 اندازه­گیری می­شود. مخلوط واکنشگر متشکل از 2/0 میلی‌لیتر EDTA (Ethylenediamine tetra-acetic acid) mM8/0، 1/0 میلی­لیتر آزید سدیم (Sodium azide) mM10، 1/0 میلی­لیتر پراکسید هیدروژن mM5/2، 2/0
میلی­لیتر هموژنات بود که در 37 درجه ‌سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه انکوبه گردید. واکنش با افزودن 5/0 میلی­لیتر تری‌کلرواستیک اسید 10 درصد متوقف و لوله­ها با 2000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. 3 میلی­لیتر دی سدیم هیدروژن mM 8/0 و 1/0 میلی­لیتر DTNB 04/0 درصد به محلول شناور افزوده شد و بلافاصله رنگ حاصله در nm420 اندازه­گیری شد. فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز به صورت میکرومول گلوتاتیون اکسید/دقیقه/میلی­گرم پروتئین بیان گردید.

هـ) اندازه­گیری فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز

فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز با استفاده از روش Mohandas و همکاران (24) بر اساس واکنش ذیل مورد سنجش قرار گرفت.

NADPH + H+ + GSSG → NADP+ + 2GSH

در حضور گلوتاتیون ردوکتاز، گلوتاتیون اکسیده، احیاء گردیده و هم زمان، NADPH به NADP+ اکسیده می­شود. فعالیت آنزیم در دمای اتاق توسط سنجش میزان ناپدید شدن NADPH/ دقیقه در nm340، با اسپکتروفتومتر اندازه­گیری گردید.

تحلیل آماری

برای تحلیل داده­ها از بسته نرم افزاری SPSS ویرایش 13 استفاده شد. داده­های به دست آمده کمّی، به صورت
میانگین ± انحراف استاندارد ارائه و اختلاف معنی­دار بین گروه­ها توسط آزمون آماری آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تعقیبی توکی مورد ارزیابی قرار گرفت. اختلافات در سطح 05/0p< معنی­دار تلقی شد.

یافته­ها

   در موش­های صحرایی سالم مصرف عصاره تغییر معنی­داری را در میزان پارامترهای مورد سنجش در مقایسه با گروه شاهد ایجاد نکرد. در موش­های صحرایی تیمار شده با ایزونیازید مقادیر آنزیم­های سوپراکسید دسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز، در مقایسه با گروه شاهد، به طور معنی­داری (001/0p<) کاهش و میزان مالون دی آلدئید به طور معنی­داری (001/0p<) افزایش یافت. تیمار با محلول 5/1% عصاره چای سبز مقادیر آنزیم­های آنتی اکسیدانی فوق را که در اثر ایزونیازید کاهش یافته بود، به طور معنی­دار  (05/0p<) افزایش داد، لکن این میزان مصرف عصاره هرگز نتوانست مقادیر آنزیم­های مذکور را به حد طبیعی برساند. تیمار با عصاره چای سبز مقدار افزایش یافته مالون دی آلدئید را در موش­های تیمار شده با ایزونیازید نیز به طور معنی­دار (05/0p<) کاهش داد، لکن این میزان مصرف عصاره هم چنان نتوانست مقدار مالون دی آلدئید را در موش­های تیمار شده با ایزونیازید به حد طبیعی خود برساند (نمودارهای 1 تا 5).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 1- تأثیر عصاره چای سبز بر میزان مالون­دی­آلدئید کبد در آسیب ناشی از ایزونیازید در موش ‌صحرایی‌ (میانگین ± انحراف استاندارد) a: نشانگر اختلاف معنی­دار با گروه 1،b : نشانگر اختلاف معنی­دار با گروه 3

 

 

 

نمودار 2- تأثیر عصاره چای سبز بر فعالیت سوپراکسید دسموتاز کبد در آسیب ناشی از ایزونیازید در موش ‌صحرایی‌ (میانگین ± انحراف استاندارد) a: نشانگر اختلاف معنی­دار با گروه 1،b : نشانگر اختلاف معنی­دار با گروه 3

 


 

 

 

 

 

نمودار 3- تأثیر عصاره چای سبز بر فعالیت کاتالاز کبد در آسیب ناشی از ایزونیازید در موش ‌صحرایی‌ (میانگین ± انحراف استاندارد) a: نشانگر اختلاف معنی­دار با گروه 1،b : نشانگر اختلاف معنی­دار با گروه 3

 

 

نمودار 4- تأثیر عصاره چای سبز بر فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز کبد در آسیب ناشی از ایزونیازید در موش ‌صحرایی‌ (میانگین ± انحراف استاندارد) a: نشانگر اختلاف معنی­دار با گروه 1،b : نشانگر اختلاف معنی­دار با گروه 3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 5- تأثیر عصاره چای سبز بر فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز کبد در آسیب ناشی از ایزونیازید در موش ‌صحرایی‌ (میانگین ± انحراف استاندارد) a: نشانگر اختلاف معنی­دار با گروه 1،b : نشانگر اختلاف معنی­دار با گروه 3


بحث و نتیجه‌گیری

  بررسی حاضر، همان طورکه قبلاً نیز به آن اشاره شد، اولین مطالعه­ای است که به بررسی اثرات محافظتی عصاره چای سبز در برابر سمیت کبدی ایزونیازید پرداخته است. در این مطالعه، تزریق داخل صفاقی ایزونیازید به میزان mg/kg50 در مدت 8 هفته باعث آسیب شدید کبد شد به طوری که افزایش قابل توجه میزان مالون­دی­آلدئید و کاهش فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز را در بافت کبد به همراه داشت. نتایج بررسی حاضر از این لحاظ با یافته­های Prabakan و همکارانش در سال 2000، Tasduq و همکاران در سال 2005 و Santhosh و همکاران در سال 2007 همخوانی دارد (31، 36 و 39).

ایزونیازید یک القاء کننده قوی سیستم سیتوکروم P450 است که تولید متابولیت­های سمی داروها و اتصال کووالان آنها به ماکرومولکول­های کبدی را سبب می­گردد (30). به عبارتی دیگر، بیوترانسفورماسیون ایزونیازید به متابولیت­های فعال که قادر به اتصال به ماکرومولکول­های سلول­های کبدی هستند، منجر به آسیب کبد می­شود (11). تحقیقات نشان داده است که استرس اکسیداتیو مکانیسم اصلی ایزونیازید در ایجاد اثرات توکسیک در کبد موش­های صحرایی است (1). یافته­های مطالعه حاضر الگوی فوق را مورد تأیید قرار می­دهد به طوری که، در بافت کبد موش­های گروه دریافت­کننده ایزونیازید (گروه 3) افزایش معنی­داری در میزان پراکسیداسیون لیپیدی مشاهده شد که این خود در راستای کاهش معنی­دار آنزیم­های آنتی اکسیدانی مورد مطالعه بود.

در این مطالعه به نظر می­رسد که رادیکال­های آزاد حاصل از واکنش متابولیت­های ایزونیازید با اکسیژن یا واکنش
رادیکال­های سوپراکسید با پراکسیدهیدروژن باعث پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی و همچنین اسیدهای چرب غیر اشباع توری داخل سیتوپلاسمی گردیده است که منجر به تشکیل پراکسیدهای لیپیدی (مالون­دی­آلدئید) و از بین رفتن تمامیت غشاء سلول و در نهایت آسیب کبد شده است. افزایش میزان مالون­دی­آلدئید در موش­های تیمارشده با ایزونیازید، نشاندهنده افزایش واکنش­های پراکسیداسیونی است که به ضعف مکانیسم­های تدافعی آنتی­اکسیدانی نیز منجر گردیده و بدین ترتیب ممانعت از تولید مفرطِ رادیکال­های آزاد هم مقدور نخواهد بود (25). به عبارتی دیگر افزایش میزان مالون دی­آلدئید در کبد در اثر ایزونیازید حاکی از افزایش پراکسیداسیون لیپیدی است که منجر به آسیب بافت کبد و هم چنین ناتوانی مکانیسم تدافعی آنتی اکسیدانی در ممانعت از تشکیل بی­رویه رادیکال­های آزاد می­گردد.

سوپراکسید دسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز آنزیم­های آنتی­اکسیدانی هستند که یک سیستم تدافعی را علیه گونه­های فعال اکسیژن (Reactive oxygen species; ROS) تشکیل داده­اند (18).

کاهش فعالیت سوپراکسید دسموتاز شاخصی حساس در مورد آسیب سلول­های کبدی است. این آنزیم یکی از مهم­ترین عوامل در سیستم تدافعی آنتی اکسیدانی آنزیماتیک است. سوپراکسید دسموتاز آنیون سوپراکسید را از طریق تبدیل آن به پراکسید هیدروژن پاکسازی نموده و بدین ترتیب اثرات توکسیک آن را کاهش می­دهد (6). در بررسی حاضر، میزان سوپراکسید دسموتاز در موش­های تیمار شده با ایزونیازید به دلیل تشکیل فراوان آنیون­های سوپراکسید، به طور معنی­داری کاهش یافت. همچنین فعالیت آنزیم­های زداینده پراکسید هیدروژن یعنی کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز نیز در این
موش­ها به طور معنی­داری کاهش یافت. به نظر می­رسد که غیرفعال شدن سوپراکسید دسموتاز توسط آنیون­های افزایش یافته سوپراکسید، منجر به غیرفعال شدن آنزیم­های کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز می­شود. در مطالعه ما، مصرف عصاره چای سبز مانع از کاهش سوپراکسید دسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز شد که این ممکن است در اثر زدایش رادیکال­ها توسط عصاره باشد که منجر به حفظ و بقاء این آنزیم­ها شده است.      

کاتالاز آنزیم آنتی­اکسیدانی است که در بافت­های حیوانی به طور گسترده­ای منتشر بوده و دارای بیشترین فعالیت در کبد و گلبول­های قرمز است. کاتالاز پراکسید هیدروژن را تجزیه
می­کند و باعث محافظت بافت­ها از رادیکال­های بسیار فعال هیدروکسیل می­شود (4). بنابراین کاهش فعالیت کاتالاز ممکن است منجر به برخی اثرات مخرب ناشی از رادیکال سوپراکسید و پراکسید هیدروژن گردد.

گلوتاتیون ردوکتاز یک آنزیم سیتوزولی کبدی است که در کاهش گلوتاتیون اکسید (GSSG) -به عنوان محصول نهایی فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز بر روی گلوتاتیون احیاء (GSH)- دخیل است (26). در بررسی حاضر، متعاقب تیمار با ایزونیازید کاهش قابل توجهی در میزان گلوتاتیون پراکسیداز حاصل گردید که منجر به دسترسی گلوتاتیون ردوکتاز به سوبسترا شده و بدین ترتیب فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز کاهش یافته است. در بررسی ما، چای سبز در کنار ایزونیازید فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز را مجدداً برقرار نموده که مصرف گلوتاتیون اکسید را جهت تشکیل گلوتاتیون احیاء و افزایش سم­زدایی متابولیت­های فعال توسط کونژوگاسیون با گلوتاتیون احیاء برقرار کرده است.

پلی­فنل­ها (polyphenols)، به­خصوص کاتچین­ها (catechins) از عمده­ترین اجزای محلول در آب چای سبز می­باشند. مهم­ترین کاتچین­های چای سبز عبارتند از: اپیکاتچین (epicatechin; EC)، اپیگالوکاتچین (epigallocatechin; EGC)، اپیکاتچین گالیت (epicatechin gallate) و اپیگالوکاتچین گالیت (epigallocatechin gallate). تحقیقات درون­تنی (in vitro) و برون­تنی (in vivo) انجام شده طی دهه اخیر، نشان داده است که چای سبز و پلی­فنل­های آن دارای اثرات آنتی­اکسیدانی قوی می­باشند (12، 13، 37 و 41). کاتچین­های چای سبز، زداینده­های قدرتمند سوپراکسید، پراکسید هیدروژن، رادیکال­های هیدروکسیل و نیتریک اکسید حاصل از مواد شیمیایی مختلف می­باشند. کاتچین­ها همچنین به دلیل ساختار کاتکولی (catechol structure) خود به فلزات متصل شده و مانع از تشکیل رادیکال­های آزاد توسط آنها می­گردند (32). به­علاوه، کاتچین­های چای سبز خواص آنتی اکسیدانی اورات، بتا کاروتن، ویتامین C و ویتامین E را در محافظت از سلول دارا می­باشند (29). مطالعات زیادی در مورد اثرات محافظتی چای سبز در مقابل اثرات توکسیک مواد شیمیایی مختلف انجام شده است. Jiao و همکارانش در سال 2003 اثرات محافظتی پلی­فنل­های چای سبز را در برابر سمیت داروی فنوفیبرات (داروی کاهنده چربی خون) بر سلول­های HepG2 انسانی نشان داده­اند (16). Guo و همکارانش در سال 2005 اثرات محافظتی پلی­فنل­های چای سبز را در برابر آپوپتوزیس سلول­های SH-SY5Y در اثر داروی ضد پارکینسون 6-OHDA (6-hydroxydopamine)، گزارش کرده­اند (14).Sai  و همکاران وی در سال 1998 اثرات محافظتی چای سبز را در برابر سمیت کبدی، آسیب اکسیداتیو DNA و پرولیفراسیون سلولی در کبد موش­های صحرایی، در پی تجویز مکرر خوراکی 2-نیتروپروپان (2-Nitropropane) به اثبات رسانده­اند (34). مطالعات انجام شده توسط  Mehana و همکاران در سال 2010 نشان داده است که عصاره چای سبز قادر است کبد موش­های صحرایی را در برابر سمیت کبدی سرب محافظت کند (22). Chuan و همکارانش در سال 2007 اثرات محافظتی پلی­فنل­های چای سبز را بر سمّیت کبدی میکروسیستین (microcystin-LR) در موش گزارش کرده­اند (5). Dobrzyńska و همکاران در سال 2005 تأثیر حفاظتی چای سبز را بر غشاء گلبول­های قرمز موش­های صحرایی با سنین مختلف که توسط اتانول مسموم شده بودند، مشخص کردند (7). در تحقیقاتی که Hong و همکاران در سال 2001 انجام دادند، اثرات محافظتی چای سبز را بر آسیب ایسکمی-بازخونرسانی مغز در موش­­های بیابانی مغولی (Mongolian gerbils) نشان دادند (15). نتایج مطالعه ما نیز گزارش فوق را در خصوص اثرات آنتی اکسیدانی و زدایش رادیکال آزاد چای سبز مورد تائید قرار می­دهد.

نتایج بررسی حاضر، اثرات مفید فارماکولوژیکی عصاره چای سبز را در برابر سمیّت کبدی ایزونیازید نشان می­دهد که پس از انجام کارآزمایی­های شاهدار اتفاقی و حصول نتایج مثبت، این گیاه می­تواند به عنوان یک داروی گیاهی با خواص آنتی‌اکسیدانی، به‌صورت مکمل و افزودنی غذایی و یا از طریق صنایع داروسازی جهت پیشگیری از آسیب­های کبدی ناشی از استرس اکسیداتیو متعاقب درمان با ایزونیازید در مورد انسان مورد استفاده قرار گیرد. لکن، تعیین تأثیر دوزهای مختلف عصاره و شناخت دقیق مکان و مکانیسم یا مکانیسم­های مولکولی و سلولی مؤثر در عملکرد فارماکولوژیکی آن نیاز به مطالعات آتی دارد.

 

  1. Attri S, Rana SV, Vaiphei K, Sodhi CP, Kaytal R, Goel RC, et al. Isoniazid and rifampicin induced oxidative hepatic injury protection by N-acetylcysteine. Hum Exp Toxicol 2000; 19: 517-22.
  2. Claiborne, A. Catalase activity. In: Boca RatonFL, editor. CRC Handbook of methods for oxygen radical research. Florida: CRC Press, Boca Raton; 1985.P.283-4.
  3. Crespy V and Williamson G. 2004. A review of the health effects of green tea catechins in in vivo animal models, J Nutr 134:3431S–3440S.
  4. Chance B, Greenstein DS, Roughton RJW. The mechanism of catalase action. 1. Steady-state analysis. Arch Biochem Biophys 1952; 37:301-21.
  5. Chuan XuWei-Qun ShuZhi-Qun Qiu, Ji-An Chen, Qing Zhao and Jia Cao. 2007. Protective effects of green tea polyphenols against subacute hepatotoxicity induced by microcystin-LR in mice. Environmental Toxicology and Pharmacology. 24(2):140-148.
  6. Curtis SJ, Mortiz M, Sondgrass PJ. Serum enzyme derived from liver cell fractions. The response of carbon tetrachloride intoxication in rats. Gastroentrology 1972; 62:84-92.
  7. Dobrzyńska I, Szachowicz-Petelska B, Ostrowska J, Skrzydlewska E and Figaszewski Z. 2005. Protective effect of green tea on erythrocyte membrane of different age rats intoxicated with ethanol.  Chemico-Biological Interactions. 156(1):41-53.
  8. Esterbauer H, Cheesman KH. Determination of aldehydic lipid peroxidation products: malonaldehyde and 4-hydroxynonenal. Methods Enzymol 1990; 186:407-21.
  9. Frei B and Higdon J. 2003. Antioxidant activity of tea polyphenols in vivo: evidence from animal studies, J Nutr 133:3275-3284.
  10. Gajalakshmi V, Peto R, Kanaka TS, Jha P. 2003. Smoking and mortality from tuberculosis and other diseases in India: retrospective study of 43000 adult male deaths and 35000 controls. Lancet 362(9383):507-15.
  11. Georgieva N, Gadjeva V, Tolekova A. New isonicotinoylhydrazones with SSA protect against oxidative-hepatic injury of isoniazid. TJS 2004; 2:37-43.
  12. Guo Q, Zhao BL, Shen SR, Hou JW, Hu JG and Xin WJ. 1999. ESR study on the structure-antioxidant activity relationship of tea catechins and their epimers. Biochim. Biophys. Acta 1427:13–23.
  13. Guo Q, Zhao BL, Li MF, Shen SR and Xin WJ. 1996. Studies on protective mechanisms of four components of green tea polyphenols against lipid peroxidation in synaptosomes. Biophys. Acta 1304:210–222.
  14. Guo S, Bezard E and Zhao B. 2005. Protective effect of green tea polyphenols on the SH-SY5Y cells against 6-OHDA induced apoptosis through ROS–NO pathway. Free Radical Biology and Medicine.  39(5): 682-695.
  15.  Hong JT,  Ryua SR,  Kima HJ,  Leea JK,  Leea SH,  Yunb YP, et al. 2001. Protective effect of green tea extract on ischemia/reperfusion-induced brain injury in Mongolian gerbils. Brain Research. 888(1):11-18.
  16. Jiao HL, Ye P. and Zhao BL.  2003. Protective effects of green tea polyphenols on human HepG2 cells against oxidative damage of fenofibrate. Free Radical Biology and Medicine. 35(9):1121-1128.
  17. Kakkar P, Das B, Viswanathan PN. A modified spectrophotometric assay of superoxide dismutase, Indian J Biochem Biophys 1984;21:130-2.
  18. Lil JL, Stantman FW, Lardy HA. Antioxidant enzyme systems in rat liver and skeletal muscle. Arch Biochem Biophys 1988;263:150-6.
  19. Lung HL, Ip WK, Wong CK, Mak NK, Chen ZY and Leung KN. 2002. Anti-proliferative and differentiation-inducing activities of the green tea catechin epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on the human eosinophilic leukemia EoL-1 cell line, Life Sci. 72 (3):257–268.
  20. Maity S, Vadasiromoni J and Ganguly D. 1998. Role of glutathione in the antiulcer effect of hot water extract of black tea. Jpn J Pharmacol 78:285–292.
  21. Mandel S, Weinreb O, Reznichenk L, Kafon L and Amit T. 2006.  Green tea catechins as brain-permeable, non toxic iron chelators to ‘iron out iron’ from the brain. J Neural Transm 71:249–257.
  22. Mehana EE, Meki AR, Fazili KM. 2010. Ameliorated effects of green tea extract on lead induced liver toxicity in rats. Experimental and Toxicologic Pathology. Article in Press.
  23. Mohamadin A, El-Beshbishy H and El-Mahdy M. 2005. Green tea extract attenuates cyclosporine A-induced oxidative stress in rats. Pharm Res 51:51–57.
  24. Mohandas J, Marshall JJ, Duggin GG, Horvath JSL, Tiller DG. Low activities of glutathione-related enzymes as factors in the genesis of urinary bladder cancer. Cancer Res 1984; 44:5086-91.
  25. Naik SR. Antioxidants and their role in biological functions: An overview. Indian Drugs 2003; 40:501-16.
  26. Naik SR, Panda VS. Hepatoprotective effect of Ginkgoselect Phytosome in rifampicin induced liver injury in rats: evidence of antioxidant activity. Fitoterapia 2008; 79:439-45.
  27. Nishikimi M, Rao NA, Yagi K. The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulphate and molecular oxygen. Biochem Biophys Res Commun 1972; 46:849-54.
  28. Ostrowska J and Skrzydlewska E. 2006. The comparison of effect of catechins and green tea extract on oxidative modification of LDL in vitro, Adv Med Sci 51: 298–303.
  29. Pietta PG, Simonetti P, Gardana C, Brusamolino A, Morazzoni P and Bombardeli E. 1998. Catechin metabolites after intake of green tea infusions. Biofactors 8:111–118.
  30. Powell-Jackson PR, Tredger JM, Smith HM, Davis M, Williams R. Effect of isoniazid administration on selected rat and mouse hepatic microsomal mixed-function oxidases and in vitro [14C]acetylhydrazine-derived covalent binding. Biochem Pharmacol 1982;31:4031-34.
  31. Prabakan M, Anandan R, Devaki T. Protective effect of Hemidesmus indicus against rifampicin and isoniazid-induced hepatotoxicity in rats. Fitoterapia 2000; 71:55-9.
  32. Rice-Evans C. and Miller N. 1997. Measurement of the antioxidant status of dietary constituents, low-density lipoproteins, and plasma. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 57:499–505.
  33. Rotruck JT, Pope AL, Ganther HE, Swanson AB, Hafeman DG, Hoekstra WG. Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science 1973; 179:588-90.
  34. Sai K,  Kai S, Umemura T,  Tanimura A,  Hasegawa R,  Inoue T and  Kurokawa Y. 1998. Protective Effects of Green Tea on Hepatotoxicity, Oxidative DNA Damage and Cell Proliferation in the Rat Liver Induced by Repeated Oral Administration of 2-Nitropropane. Food and Chemical Toxicology. 36(12):1043-1051.
  35. Sano M, Takahashi Y, Yoshino K, Shimoi K, Nakamura Y, Tomita I, Oguni I and Konomoto H. 1995. Effect of tea (Camellia sinensis L.) on lipid peroxidation in rat liver and kidney: a comparison of green and black tea feeding, Biol. Pharm. Bull. 18 (7):1006–1008.
  36. Santhosh S, Sini TK, Anandan R, Mathew PT . Hepatoprotective activity of chitosan against isoniazid and rifampicin-induced toxicity in experimental rats. Eur J Pharmacol; 2007; 572:69-73.
  37. Shen SR, Yang XQ, Yang FJ, Zhao BL and Xin WJ.  1993. Synergic antioxidant effect of tea catechins. J. Tea Sci. 13:141–146.
  38. Sodhi CP, Rana SV, Mehta SK, Vaiphei K, Attari S and Mehta S. 1997. Study of oxidative-stress in isoniazid-rifampicin induced hepatic injury in young rats. Drug Chem Toxicol 20(3):255-269.
  39. Tasduq SA, Peerzada K, Koul S, Bhat R, Johri RK. Biochemical manifestations of anti-tuberculosis drugs induced hepatotoxicity and the effect of silymarin. Hepatol Res 2005; 31:132-5.
  40. Yang CS, Kim S, Yang GY, Lee MJ, Liao J, Chung JY and Ho CT. 1999. Inhibition of carcinogenesis by tea: bioavailability of tea polyphenols and mechanisms of actions, Proc. Exp. Bio. Med. 220(4):213–217.
  41. Zhao BL, Li XJ, He R, Cheng SJ and Xin WJ. 1989. Scavenging effect of extracts of green tea and natural antioxidants on active radicals. Cell Biophys. 14:175-185.