مطالعه هیستوپاتولوژی تاثیر کروسین در پیشگیری از بیماری کبد چرب در موش‌های صحرایی تغذیه شده با جیره پر چرب

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، گروه پاتوبیولوژی، تبریز، ایران

2 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، گروه علوم درمانگاهی، تبریز، ایران

چکیده

بیماری کبد چرب غیر الکلی امروزه به­عنوان شایع­ترین بیماری کبد شناخته شده است و احتمال دارد از لحاظ موضوع سلامت به یک معضل عمومی مهم تبدیل شود. هدف از مطالعه حاضر ارزیابی اثرات محافظتی کروسین، در برابر کبد چرب  ناشی از رژیم غذایی پرچرب در مدل موش صحرایی می­باشد. به این منظور، مو­ش­های صحرایی نر نژاد ویستار در گروه­های آزمایشی متفاوت، توسط رژیم غذایی شاهد، رژیم غذایی صرفاً پرچرب و رژیم غذایی پرچرب به علاوه گاواژ کروسین در دزهای مختلف (mg kg-1/day 25، 50 و 100 ) تیمار شدند. در پایان دوره آزمایش، برای ارزیابی هیستوپاتولوژی کبد، هم‌زمان همه موش‌‌ها با ایجاد جابجایی در مهره‌های گردن به راحتی کشته شدند. نمونه‌های بافتی اخذ شده از کبد تمامی موش‌ها در فرمالین بافری 10 درصد پایدار گردید. از نمونه‌های فوق با استفاده از شیوه‌های رایج پاساژ بافت و تهیه مقطع، برش‌های هیستولوژی به ضخامت 5 میکرون تهیه گردید. سطوح سرمی آمینوترانسفرازها (ALT و AST) جهت ارزیابی آسیب کبد و آلکالین فسفاتاز (ALP) و بیلی­روبین تام (TB) برای ارزیابی عمکرد صفراوی کبد مورد سنجش قرار گرفت. آلبومین (Alb) و پروتئین تام (TP) نیز برای سنجش عملکرد ساخت­وساز کبد اندازه­گیری گردید. آسیب‌شناسی بافتی کبد، حاکی از بروز تغییر چربی در گروه موش­های تغذیه شده با جیره پرچرب بود. کروسین به صورت وابسته به دز باعث کاهش تجمع چربی در هپاتوسیت­ها گردید. در موش‌های گروه تغذیه با جیره پر چرب، سطوح سرمی آنزیم­های ALT، AST و ALP و TB در مقایسه با گروه شاهد سالم، به‌طور معنی‌داری (01/0p<) افزایش و میزان TP و Alb به‌طور معنی‌داری (01/0p<) کاهش یافت. دزهای بالا (mg/kg 100) و متوسط کروسین (mg/kg 50) ، سطوح افزایش یافته سرمی مارکرهای آسیب کبد در اثر رژیم پرچرب را به‌طور معنی‌دار (به ترتیب 01/0p< و 05/0p<) کاهش و مقادیر کاهش یافته TP و Alb در اثر رژیم پرچرب را به‌طور معنی‌دار (به ترتیب 01/0p< و 05/0p<) افزایش دادند. دز پائین کروسین (mg/kg 25) نتوانست تغییر معنی­داری در پارامترهای مذکور ایجاد کند. نتایج مطالعه حاضر نشان می­دهد که کروسین از بروز کبد چرب در  موش­های صحرایی تغذیه شده با جیره پرچرب پیشگیری می­کند. 

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Histopathological study on the effects of Crocin on prevention of fatty liver disease in the rats fed with high fat diet

نویسندگان [English]

  • D Mohajeri 1
  • A Rezae 2
  • GH Mousavi 2
  • J Rahmani 2
1 Departement of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Tabriz Branch, Islamic Azad University, Tabriz, Iran
2 Departement of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Tabriz Branch, Islamic Azad University, Tabriz, Iran
چکیده [English]

Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is now recognized as the most common type of liver disease and might lead to an important public health problem. The aim of the present study was to evaluate the protective effects of Crocin on rat high fat diet-induced hepatic steatosis model. For this purpose male Wistar rats were given either control diet, high fat diet alone or high fat diet plus Crocin via gavage at different doses (25, 50 and 100 mg/kg) for 4 weeks in different experimental groups. Histopathological studies of the liver were conducted in all experimental rats at the end of experiment. Animals of the different groups were sacricified by cervical dislocation. Liver issue specimens were fixed in 10% buffered formalin and 5 micron thick sections were prepared using routine hitopathological techniques.The serum levels of aminotransferases, alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were measured to determine hepatocyte injury. Alkaline phosphatase (ALP) and total bilirubin (TB) were measured to assess biliary function. Albumin (Alb) and total protein (TP) was measured to reflect liver synthetic function. Histopathology of the liver in high fat diet fed rats showed severe fatty change of hepatocytes. Crocin reduced accumulation of lipid droplets in the hepatocytes in a dose dependent manner. In the high fat diet fed rats, serum levels of ALT, AST, ALP and TB significantly (p<0.01) increased, and serum Alb as well as TP levels significantly (p<0.01) reduced in comparison with normal control rats. Crocin treatments (100 and 50 mg/kg) significantly (p<0.01 and p<0.05, respectively) reduced elevated markers of liver tissue injury and significantly (p<0.01 and p<0.05, respectively) increased serum Alb and TP levels in high fat diet fed rats. Low dose of Crocin (25 mg/kg) made no significant changes in the mentioned parameters. The results obtained showed that Crocin has protective effects against hepatic steatosis in rats fed with high fat. 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Liver steatosis
  • High fat fed diet
  • Crocin
  • Rats

مقدمه

 

کبد چرب غیرالکلی (Non alcoholic fatty liver disease; NAFLD) به عنوان معضلی جهانی، گریبانگیر بشر بوده که معمولاً با چاقی مفرط، هیپرلیپیدمی و دیابت ملیتوس نوع 2 همراه می­باشد. تحقیقات نشان داده­ است که تغدیه با جیره پرچرب منجر به استئاتوز کبد می­گردد (4). تری­گلیسرید و کلسترول، لیپیدهای بیولوژیک مهمی هستند که دریافت بیش از حد آنها از طریق جیره غذایی منجر به هیپرتری­گلیسریدمی (17 و 19) و هیپرکلسترولمی (33) می­گردد. کبد چرب غیرالکلی با تجمع تری­گلیسریدها در هپاتوسیت­ها که در اثر استریفیکاسیون اسیدهای چرب آزاد  و گلیسرول شکل می­گیرند، مشخص می­شود. افزایش اسیدهای چرب آزاد در کبد از سه منبع جداگانه یعنی لیپولیز (هیدرولیز اسید چرب و گلیسرول از تری­گلیسیرید) در بافت چربی، رژیم غذایی پر چرب و لیپوژنز مجدد (de novo lipogenesis) سرچشمه می­گیرد (28). در مقابل، اسیدهای چرب ممکن است از طریق بتا-اکسیداسیون (β-oxidation)، استریفیکاسیون مجدد به تری­گلیسریدها و ذخیره به شکل قطرات چربی ، یا دفع به صورت VLDL (very low density lipoprotein) مصرف شوند. بنابراین، تجمع چربی در کبد  می­تواند در اثر افزایش سنتز چربی، کاهش دفع چربی و یا کاهش اکسیداسیون آن به وقوع بپیوندد.  Donnelly و همکارانش در سال 2005 نشان داده­اند که 60% محتوای تری­گلیسرید کبد از اینفلاکس اسیدهای چرب از بافت چربی، 26% از لیپوژنز مجدد، و 15% از جیره غذایی منشا می­گیرد (13). کبد چرب غیر الکلی با یکسری تغییرات هیستوپاتولوژیک که از استئاتوز تا سیروز متفاوت است، همراه می­باشد (3، 9، 12 و 15). سابقاً عقیده بر این بود که استئاتوز پدیده­ای ساده بوده و بدون عوارض می­باشد. لکن، امروزه مشخص شده است که کبد چرب به عواملی همچون استرس­های اکسیداتیو آسیب­پذیر بوده و می­تواند به استئاتوهپاتیت (Steatohepatit) که با نکروز، آماس، فیبروز و سیروز مشخص می­شود، منجر گردد (18 و 27). در پاتوژنز استئاتوهپاتیت غیر الکلی (non-alcoholic steatohepatitis (NASH)) فرض بر این است که تجمع تری­گلیسرید در کبد یا استئاتوز باعث افزایش حساسیت کبد به آسیب­های ناشی از سیتوکائین­ها یا لیپوکائین­های آماسی، اختلالات عملکردی میتوکندری­ها و استرس اکسیداتیو خواهد شد که خود منجر به استئاتوهپاتیت و یا فیبروز می­­شود (10 و 11). Barbuio و همکارانش در سال 2007 نشان داده­اند که استرس اکسیداتیو در تبدیل استئاتوز به استئاتوهپاتیت موثر می­باشد (5). به هرحال، اگرچه استئاتوز ممکن است به نارسایی کامل کبد منجر شود، لکن درمان مناسب و ایده­آلی برای آن بنا نشده است (3). مواد بیولوژیک با منشأ گیاهی شاخه‌ای از فارماکوتراپی مدرن بیماری‌ها را تشکیل می‌دهند. اگر چه عوامل دارویی متنوعی برای درمان انواع بیماری‌ها وجود دارد، لکن اغلب بیماران قادر به تحمل اثرات جانبی داروهای شیمیایی نیستند و از سوی دیگر اکثر گیاهان اثرات جانبی بسیار اندکی در روی بیماران به جای می‌گذارند. بدیهی است قبل از آن­که دارویی جدید وارد عرصه طب شود، لازم است مطالعات متعددی در چندین مرحله روی دارو انجام شود. در اولین مرحله، دارو در محیط­های بی­جان (in vitro) و نیز روی حیوانات زنده (in vivo) بررسی می­شود که در این مرحله ویژگی­های کلی را روی مورد مطالعه (pharmacological profile) مورد بررسی قرار می­دهند. بعد از این مرحله است که دارو روی انسان آزمایش می­شود.

کروسین (Crocin) به عنوان یک کاروتنوئید گلیکوزیله (glycosylated carotenoid) ماده­­ای است که دارای اثرات هیپوتری­گلیسریدمیک و هیپو کلسترولمیک قوی می­باشد (16). مطالعات متعدد نشان داده­اند که کروسین دارای اثرات فارماکولوژیک متعدد از جمله اثرات محافظتی علیه بیماری­های قلبی-عروقی (16، 30 و 35)، جلوگیری از پرولیفراسیون سلول­های توموری (24)، محافظت از سیستم عصبی (1 و 26) و محافظت از هپاتوسیت­ها (32) را نیز دارا می­باشد. در هر صورت، در بین مکانیسم­های محافظتی مختلف، فعالیت آنتی­اکسیدانی کروسین مسئول اثرات فارماکولوژیکی آن قلمداد شده است (24).

با توجه به اثرات هیپولیپیدمیک  و آنتی­اکسیدانی کروسین (31)، این ماده احتمالاً توانایی آن را خواهد داشت که بتواند کبد را از ابتلاء به استئاتوز و در پی آن آسیب­های ناشی از تنش­های اکسایشی محافظت کند. در هر صورت با توجه به  بررسی منابع، مطالعه‌ای در رابطه با اثرات پیشگیری­کنندگی کروسین از ابتلاء به استئاتوز کبد در موارد تغذیه با جیره پر چرب وجود ندارد. بنابراین، تحقیق حاضر برای اولین بار جهت ارزیابی اثرات پیشگیری­کنندگی کروسین از استئاتوز کبد در موش­های صحرایی تغذیه شده با جیره پر چرب اجرا گردیده است. به هر حال، با انجام این مطالعه خاصیت دارویی کروسین در پیشگیری از بروز عارضه کبد چرب در مواقع تغذیه با جیره پر چرب برای اولین بار مورد ارزیابی قرار می‌گیرد که در صورت تائید می‌تواند به عنوان یک منبع قابل دسترس با خاصیت هیپولیپیدمیک و  آنتی‌اکسیدانی جهت پیشگیری از استئاتوز و عوارض وخیم ناشی از آن مورد استفاده قرار گیرد.

مواد و روش­ها

   مطالعه حاضر از نوع تجربی آزمایشگاهی بوده و در سال 1390 در مرکز تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی تبریز انجام گردید. جامعه آماری این مطالعه شامل موش‌های‌ صحرایی نر نژاد ویستار در محدوده وزنی 20±180 گرم و سن 9 هفته بود. نمونه‌ای به حجم 60 سَر موش صحرایی از مرکز پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه آزاد اسلامی تبریز تهیه و به‌طور تصادفی به 6 گروه مساوی شامل: 1-گروه شاهد سالم 2-گروه تغذیه با جیره پر چرب 3- گروه تغذیه با جیره پر چرب + کلوفیبرات Clofubrate (به عنوان کنترل مثبت)، 4 تا 6- گروه­های تغذیه با جیره پر چرب + کروسین (mg kg-1/day 25، 50 و 100 ) تقسیم گردید. موش‌ها برای سازگاری با محیط جدید، قبل از آغاز مطالعه به مدت یک هفته در قفس‌های فایبرگلاس مخصوص در شرایط 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی و دمای C°2 ± 23 و دسترسی آزاد به مقادیر دلخواه آب و غذای پودر شده استاندارد نگه‌داری شدند. در این مطالعه کلیه ملاحظات اخلاقی و پروتکل‌های کار روی حیوانات آزمایشگاهی، مورد تائید کمیته نظارت بر حقوق حیوانات آزمایشگاهی مرکز تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی تبریز بود. مراحل مختلف مطالعه به‌صورت دوسو بی­خبر انجام شد.

الف-طرح آزمایش:

در گروه­های تغذیه با جیره پر چرب، برای ایجاد استئاتوز کبد، از امولسیون پرچرب طبق روش ارائه شده توسط Zou و همکاران در سال 2006 استفاده شد که شامل 400 گرم روغن ذرت، 150 گرم ساکاروز، 80 گرم پودر کامل شیر، 100 گرم کلسترول، 10 گرم سدیم دی­اکسی­کولات، 4/36 گرم توئین 80، 1/31 گرم پروپیلن گلیکول، 5/2 گرم مولتی ویتامین، 10 گرم نمک، 5/1 گرم مواد معدنی مخلوط و 300 میلی­لیتر آب مقطر بود (36). به طور خلاصه، موش­های گرو­ه­های 2 تا 6، امولسیون پرچرب را به میزان  ml/kg10، روزانه راس ساعت 8 صبح به مدت 4 هفته از طریق گاواژ دریافت کردند. همزمان به موش­های گروه شاهد نیز به همان میزان (ml/kg 10) نرمال سالین گاواژ شد. گروه­های تیمار با کروسین (گروه­های 4 تا 6) نیز کروسین را به میزانmg/kg/day  25، 50 و 100 و گروه کنترل مثبت، کلوفیبرات را به میزان mg/kg/day  320  (31)  از طریق گاواژ به صورت سوسپانسیون در متیل سلولز 5/0% (ml/kg 2) دریافت کردند. به موش­های گروه شاهد نیز به همان میزان (ml/kg 2) متیل سلولز 5% گاواژ گردید.

ب) سنجش پارامترهای بیوشیمیایی سرم

 در پایان دوره آزمایش جهت اندازه‌گیری برخی فاکتور‌های بیوشیمیایی  شامل آلانین آمینو ترانسفراز (ALT; alanine amino transaminase )، آسپارتات آمینو ترانسفراز (AST; aspartate amino transaminase)  (29)، آلکالین فسفاتاز (ALP; alkaline phosphatase)  (20)، آلبومین (Alb; albumin) و پروتئن تام (TP, total protein)، (23) و بیلی‌روبین تام (TB; total bilirubin) (25)، نمونه‌ خون ناشتا از سینوس پشت کره چشم (retro-orbital plexus) اخذ گردید.  سرم نمونه‌های خون توسط سانتریفیوژ با سرعت 2500 دور در دقیقه و به مدت 15 دقیقه در دمای 30 درجه سانتی‌گراد جدا شد. جهت سنجش پارامترهای مذکور از کیت­های تجاری موجود (Commercial analysis kits; Beijing, China) استفاده شد.

ج- هیستوپاتولوژی کبد:

آسیب­شناسی بافتی کبد موش­های مورد آزمایش با رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) انجام شد. قسمتی از بافت کبد موش‌ها در فرمالین بافری 10 درصد پایدار شد و از نمونه‌های پایدار شده با استفاده از شیوه‌های رایج پاساژ بافت و تهیه مقاطع هیستولوژی، برش‌هایی با ضخامت 5 میکرون و رنگ آمیزی معمول هماتوکسیلین- ائوزین تهیه شد (22). تغییرات هیستوپاتولوژی کبد به صورت تغییر چربی (fatty Change) هپاتوسیت­ها بر اساس شدت ضایعه طبق روش (6 و 34)، از صفر تا 4 (صفر: بدون استئاتوز، 1: کمتر از 25% هپاتوسیت­ها دچار استئاتوز هستند، 2: بین 26 تا 50% هپاتوسیت­ها دچار استئاتوز هستند، 3: بین 51 تا 75% هپاتوسیت­ها دچار استئاتوز هستند و 4: بیش از 76% هپاتوسیت­ها دچار استئاتوز هستند.) رتبه‌بندی گردید. کلّیه درجه‌‌بندی‌ها با بزرگنمایی 100×  و در 5

میدان میکروسکوپی از هر برش، به‌طور تصادفی با میکروسکوپ نوری مدل Nikon (ECLIPSE E200، ساخت کشور ژاپن) انجام شد.

د) تحلیل آماری داده­ها

برای تحلیل داده‌ها از بسته نرم‌افزاری SPSS-13 استفاده شد. داده‌های به‌دست آمده کمّی، به صورت میانگین±انحراف استاندارد (mean±SEM.) ارائه و اختلاف معنی‌دار بین گروه‌ها توسط آزمون آماری آنالیز واریانس یک­طرفه (ANOVA) و آزمون تعقیبی توکی (Tukey) مورد بررسی قرار گرفت. آزمون ناپارامتری کروسکال والیس (The Kruskal-Wallis test) و آزمون تعقیبی یو مان- ویتنی (Mann-Whitney U Test) نیز برای آنالیز درجات هیستوپاتولوژیک استئاتوز کبد مورد استفاده قرار گرفت. اختلافات در سطح 05/0p< معنی‌دار تلقی شدند. از آزمون آماری کلموگروف–اسمیرنف (Kolmogrov-Smirnov) که یکی از آزمون­های نیکویی برازش است، نیز برای تعیین نرمال بودن توزیع پراکندگی داده­ها استفاده شد.

یافته­ها

الف-تاثیر کروسین بر تغییر پارامترهای بیوشیمیایی آسیب کبد ناشی از تغذیه با رژیم پرچرب 

در موش‌های گروه  2 (گروه تغذیه با جیره پر چرب)، سطوح سرمی آنزیم­های آلانین ‌آمینوترانسفراز (ALT)، آسپارتات ‌آمینوترانسفراز (AST) و آلکالین فسفاتاز (ALP) و بیلی‌روبین تام سرم (TB) در مقایسه با گروه 1 (شاهد سالم)، به‌طور معنی‌داری (01/0p<) افزایش و میزان پروتئین تام (TP) و آلبومین سرم (Alb) به‌طور معنی‌داری (01/0p<) کاهش یافت. در گروه  3 (شاهد مثبت)، کلوفیبرات (mg/kg 320) و در گروه­ 6، دز بالای کروسین (mg/kg 100)، سطوح افزایش یافته سرمی آنزیم‌های ALT، AST و ALP و بیلی‌روبین تام سرم در اثر رژیم پرچرب را به‌طور معنی‌دار (01/0p<) و تا حدّ طبیعی کاهش و مقادیر کاهش یافته پروتئین تام و آلبومین سرم در اثر رژیم پرچرب را به‌طور معنی‌دار (01/0p<) و تا سطوح طبیعی خود افزایش دادند. در گروه­ 5 نیز دز متوسط کروسین (mg kg-1 50) مقادیر افزایش یافته آنزیم‌های مارکر و بیلی‌روبین تام سرم در اثر رژیم پرچرب را  به‌طور معنی‌داری (05/0p<) کاهش و مقادیر کاهش یافته پروتئین تام و آلبومین سرم را  به‌طور معنی‌داری (05/0p<) افزایش داد، هرچند که این مقادیر به حدّ طبیعی خود نرسیدند. در گروه­ 4، دز پائین کروسین (mg kg-1 25) نتوانست مقادیر افزایش یافته آنزیم‌های مارکر و بیلی‌روبین تام سرم در اثر رژیم پرچرب را  به‌طور معنی‌داری کاهش و مقادیر کاهش یافته پروتئین تام و آلبومین سرم را  به‌طور معنی‌داری افزایش دهد (جدول 1).


جدول 1- تاثیر کروسین بر پارامترهای بیوشیمیایی سرم موش­های ‌صحرایی در استئاتوز کبد ناشی از رژیم غذایی پرچرب

گروه­ها

پارامترها

آلانین ‌آمینو ترانسفراز

(U/L)

آسپارتات ‌آمینو ترانسفراز

(U/L)

آلکالین ‌فسفاتاز

(IU/L)

بیلی‌روبین تام سرم (mg/dl)

آلبومین (g/dl)

پروتئین ‌تام‌ سرم

(g/dl)

شاهد سالم

36/2±82/54 bde

bde71/1±90/68

bde03/9±87/194

bde03/0±81/0

bde42/0±38/4

bde58/0±28/8

رژیم غذایی پر چرب

12/3±25/71acef

acef96/2±21/93

acef25/11±67/281

acef07/0±29/1

acef21/0±12/3

acef45/0±56/5

رژیم غذایی پرچرب + کلوفیبرات (mg/kg 320)

47/2±90/55bd

bd34/1±21/68

bd09/8±92/208

bd06/0±87/0

bd36/0±32/4

bd47/0±26/7

رژیم غذایی پرچرب + کروسین (mg kg-1 25)

32/3±55/69acf

24/3±76/89acf

65/9±61/275acf

06/0±25/1acf

27/0±33/3acf

42/0±65/5acf

رژیم غذایی پرچرب + کروسین (mg kg-1 50)

ab95/2±56/62

ab61/2±30/78

ab91/6±62/235

ab05/0±06/1

ab29/0±73/3

ab43/0±16/6

رژیم غذایی پرچرب + کروسین (mg kg-1 100)

bd64/2±30/56

bd15/2±91/69

bd50/8±88/214

bd40/0±85/0

bd34/0±31/4

bd52/0±21/7

آزمون آنالیز واریانس یکطرفه (ANOVA)

000/0=p

000/0=p

000/0=p

000/0=p

000/0=p

000/0=p

مقادیر به­صورت میانگین ± انحراف استاندارد (mean±SEM) برای 10 سر موش صحرایی در هر گروه ارائه شده است. a: اختلاف معنی‌دار با گروه 1،b : اختلاف معنی‌دار با گروه 2، c: اختلاف معنی‌دار با گروه 3، d: اختلاف معنی‌دار با گروه 4، e: اختلاف معنی‌دار با گروه 5، f: اختلاف معنی‌دار با گروه 6 (05/0p<).


 

ب- هیستوپاتولوژی تاثیر کروسین بر آسیب­ بافت کبد ناشی از رژیم پرچرب در مطالعات ریزبینی، هیچگونه حالت غیر طبیعی در بافت کبد موش­های گروه شاهد سالم (گروه 1) مشاهده نشد (تصویر 1). در حالی که، در موش­های گروه 2 که به مدت 4 هفته فقط با جیره پرچرب تغذیه شده بودند، استئاتوز شدید بافت کبد به صورت تغییر چربی میکرووزیکر و گاهاً ماکرووزیکولر همراه با تورم هپاتوسیت­ها ایجاد شده بود (تصویر 2). کلوفیبرات در موش­های گروه 3 که جیره پرچرب دریافت می­کردند، مانع از استئاتوز کبد شده بود (تصویر 3). در گروه­های 5 و 6 تجویز کروسین (mg/kg 100 و 50) به صورت وابسته به دز از بروز تغییر چربی در هپاتوسیت­ها پیشگیری کرد، به­خصوص با دز mg/kg 100 که تقریباً به طور کامل مانع از بروز استئاتوز در کبد شد (تصاویر 4 و 5)، در حالی­که در گروه 4، کروسین با دز mg/kg 25 نتوانست به طور مشخصی از استئاتوز بافت کبد جلوگیری کند (تصویر 6).  تاثیر کروسین بر درجه­بندی پاتولوژیک استئاتوز کبد در موش­های تغذیه شده با رژیم پرچرب در جدول 2 آورده شده است.

جدول 2- تاثیر کروسین بر استئاتوز بافت کبد موش­های صحرایی تغذیه شده با رژیم غذایی پرچرب

گروه­ها

درجه استئاتوز کبد

P

شاهد سالم

00/0 ± 00/0

001/0 P<

رژیم پر چرب

85/0 ± 97/2d

رژیم پر چرب + کلوفیبرات

11/0 ± 74/0b

رژیم پر چرب + کروسین (mg kg-1 25)

68/0 ± 65/2d

رژیم پر چرب + کروسین (mg kg-1 50)

46/0 ± 84/1ac

رژیم پر چرب + کروسین(mg kg-1 100)

25/0 ± 82/0b

هر گروه شامل 10 سر موش صحرایی بوده و ارقام نشان­دهنده تعداد موش­ها برای هر درجه از شدت استئاتوز می­باشد.

a: 05/0 p< و b: 01/0 p< در مقایسه با گروه رژیم پرچرب. c: 05/0 p< و d: 01/0 p< در مقایسه با گروه شاهد سالم.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نگاره 1- نمای ریزبینی از بافت کبد یک موش صحرایی متعلق به گروه شاهد سالم. هپاتوسیت­ها و ساختار بافت کبد طبیعی می­باشد (رنگ­آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×400).

 

 

 

 

 

نگاره 2- نمای ریزبینی از بافت کبد یک موش صحرایی متعلق به گروه تغذیه با رژیم پرچرب. تغییر چربی با تشکیل میکرووزیکول­ها و ماکرووزیکول­ها درون سیتوپلاسم هپاتوسیت­ها مشخص می­باشد (رنگ­آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×400).

 

 

 

 

 

 

 

نگاره 3- نمای ریزبینی از بافت کبد یک موش صحرایی متعلق به گروه رژیم پر چرب + کلوفیبرات (mg/kg 320). بافت کبد طبیعی بوده و تغییر پاتولوژیک خاصی در آن مشاهده نمی­شود (رنگ­آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×400).

 

 

 

 نگاره 4- نمای ریزبینی از بافت کبد یک موش صحرایی متعلق به گروه رژیم پر چرب + کروسین (mg/kg 25). وزیکول­های ریز و درشت چربی به­طور منتشر در بافت کبد مشاهده می­شود  (رنگ­آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×400).

 

 

 

 

 

 

 

 

 نگاره 5- نمای ریزبینی از بافت کبد یک موش صحرایی متعلق به گروه رژیم پر چرب + کروسین (mg/kg 50). تغییر چربی در حد متوسط بوده و قطرات ریز چربی به­صورت پراکنده قابل مشاهده می­باشد (رنگ­آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×400).

 

 

 

نگاره 6- نمای ریزبینی از بافت کبد یک موش صحرایی متعلق به گروه رژیم پر چرب + کروسین (mg/kg 100). تغییر چربی در حد بسیار جزئی بوده و قابل چشم­پوشی می­باشد (رنگ­آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×400).

 

 

 

 

 

بحث و نتیجه­گیری

     افزایش فعالیت آنزیم­های شاخص عملکرد کبد شامل AST، ALT و ALP در سرم نشانگر آسیب کبد می­باشد (8). از آنجائی­که تغییر در میزان سرمی مارکرهای فوق طی استئاتوز کبد نیز قبلاً گزارش گردیده است (2 و 34Chitturi and Farrell, 2001 S. Chitturi and G.C. Farrell, Etiopathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis, Seminars in Liver Disease 21 (2001), pp. 27–41. View Record in Scopus | Cited By in Scopus (310))، بنابراین، در بررسی حاضر سطوح سرمی این آنزیم­ها مورد مطالعه قرار گرفت.  افزایش فعالیت سرمی آنزیم­های AST، ALT و ALP در سرم موش­های مورد تغذیه با جیره پرچرب مشاهده شد که حکایت از بروز آسیب در سلول­های کبدی را دارد. این یافته با نتایج Chidambarama و Venkatraman در سال 2010 همخوانی دارد (8). تیمار با کروسین تا حد قابل توجهی از افزایش سطوح سرمی آنزیم­های مذکور، ناشی از تغذیه با جیره پرچرب، جلوگیری کرد که این تاثیر با عملکرد کلوفیبرات در گروه کنترل مثبت، قابل مقایسه می­باشد. این نتیجه با یافته­های El-Maraghy و همکاران در سال 2009 که اثرات محافظتی کروسین را در برابر افزایش سیستمیک بار آهن در موش­های صحرایی مورد مطالعه قرار داده بودند، همراستا است (14). در این مطالعه، نتایج بیوشیمیایی به دست آمده با یافته­های هیستوپاتولوژی نیز مورد تائید قرار گرفت، به طوری که موش­هایی که به مدت 4 هفته با جیره پرچرب تغذیه شده بودند، درجات بالایی از استئاتوز کبد را بروز دادند. در هر صورت، ارزیابی­های هیستوپاتولوژی اثرات ضد هپاتواستئاتوزی کروسین را در موش­های تغذیه شده با جیره پرچرب نشان داد به طوری که، کروسین به خصوص با دز  mg/kg 100 مانع از رسوب چربی در هپاتوسیت­ها شده بود. مشاهدات ریزبینی در توافق با یافته­های بیوشیمیایی، با نتایج مطالعه Wang و همکارانش در سال 2009 همسو می­باشد (34). شواهد موجود نشان می­دهد که تجمع چربی در کبد، حساسیت این بافت را نسبت به سایر عوامل آسیب­رسان نظیر استرس­های اکسیداتیو افزایش می­دهد که خود باعث پیشرفت استئاتوز به سمت استئاتوهپاتیت، فیبروز و سیروز می­شود (21). با توجه به ارتباط بین استرس اکسیداتیو و التهاب بافت (8)، بررسی حاضر تائید می­کند که رژیم غذایی پرچرب می­تواند باعث آسیب اکسیداتیو کبد شود. عدم تعادل بین استرس اکسیداتیو و تشکیل آنتی­اکسیدان­ها می­تواند متعاقب تغذیه با جیره پرچرب بروز نماید و اینکه کروسین می­تواند از این روند پاتولوژیک پیشگیری کند، اثرات درمانی و پیشگیری­کنندگی آنرا از هپاتواستئاتوز ناشی از جیره پرچرب نشان می­دهد. نتایج آزمایشات بیوشیمیایی مطالعه حاضر، در کنار یافته­های هیستوپاتولوژی، نشان می­دهد که تیمار با کروسین استئاتوز کبد را کاهش داده و مانع از آسیب پراکسیداتیو آن می­گردد به طوری که،  این اثرات با اثرات کلوفیبرات قابل قیاس می­باشد. این نتایج با یافته­های مطالعات Zou و همکاران در سال 2006 همراستا می­باشد (36). کبد نقشی اساسی را در متابولیسم چربی در بدن به عهده داشته و استئاتوز کبد نشان از تجمع بیش از حد لیپیدها در هپاتوسیت­ها به دلیل عدم تعادل در تشکیل و تجزیه چربی دارد (7). هیپرکلسترولمی، هیپرتری­گلیسریدمی، میزان کم HDL-C و سطوح بالای LDL-C در سرم اختلالات معمولی هستند که در هومئوستاز لیپیدی مبتلایان به استئاتوز کبد رخ می­دهد (3). تحقیقات نشان داده است که کروسین دارای اثرات هیپولیپیدمیک می­باشد (31). در این مطالعه، کروسین به طور معنی­داری شواهد بیوشیمیایی و هیستولوژیک مربوط به تجمع چربی در بافت کبد را بهبود بخشید. این نتایج نشان می­دهند که کروسین می­تواند از وقوع هپاتواستئاتوز از طریق کاهش تجمع لیپیدها در سرم و کبد ممانعت کند. به عبارتی دیگر کروسین اختلالات ایجاد شده در متابولیسم چربی ناشی از رژیم غذایی پرچرب را کاهش می­دهد. در مجموع، نتایج این مطالعه نشان می­دهد که کروسین به عنوان یک کاروتنوئید گلیکوزیله که نقش خود را از طریق فعالیت آنتی­اکسیدانی اعمال می­دارد، از تجمع چربی در بافت کبد در رژیم غذایی پرچرب جلوگیری

 

کرده و این تغییرات با  کاهش مارکرهای سرمی آسیب کبد همراه می­باشد. 

  1. Ahmad A.S., Ansari M.A., Ahmad M., Saleem S., Yousuf S. and Hoda M.N. et al., Neuroprotection by crocetin in a hemi-parkinsonian rat model, Pharmacology, Biochemistry and Behavior 81 (2005), pp. 805–813.
  2. Angulo P. Non alcoholic fatty liver disease, N. Engl. J. Med. 18 (346) (2002), pp. 1221–1231.
  3. Angulo P. and Lindor K.D. Non-alcoholic fatty liver disease, Journal of Gastroenterology and Hepatology 17 Suppl. (2002), pp. S186–190.
  4. Assy N., Kaita K., Mymin D., Levy C., Rosser B. and Minuk G. Fatty infiltration of liver in hyperlipidemic patients, Dig. Dis. Sci. 45 (2000), pp. 1929–1934.
  5. Barbuio R., M. Milanski, M.B. Bertolo, M.J. Saad and L.A. Vellosa, Infliximab reverses steatosis and improves insulin signal transduction in liver of rats fed a high-fat diet, J. Endocrinol. 194 (2007), pp. 539–550.
  6. Brunt E.M., Janney C.G., Di Bisceglie A.M., Neuschwander-Tetri B.A. and Bacon B.R., Nonalcoholic steatohepatitis: a proposal for grading and staging the histological lesions, The American Journal of Gastroenterology 94 (1999), pp. 2467–2474.
  7. Burt AD, Mutton A and Day CP. Diagnosis and interpretation of steatosis and steatohepatitis, Seminars in Diagnostic Pathology 15 (1998), pp. 246–258.
  8. Chidambarama J and Venkatraman AC. Cissus quadrangularis stem alleviates insulin resistance, oxidative injury and fatty liver disease in rats fed high fat plus fructose diet. Food and Chemical Toxicology, 2010 48(8-9):2021-2029.
  9. Clark J.M., Brancati F.L. and Diehl A.M. Nonalcoholic fatty liver disease, Gastroenterology 122 (2002), pp. 1649–1657.
  10. Day, C.P. and James, O.F. 1998. Steatohepatitis: a tale of two ‘hits’? Gastroenterology, 114:842-5.
  11. Day, C.P. 2006. From fat to inflammation. Gastroenterology, 130:207-10.
  12. Dixon, J.B., Bhathal P.S. and O’Brien P.E. 2001. Nonalcoholic fatty liver disease: predictors of nonalcoholic steatohepatitis and liver fibrosis in the severely obese, Gastroenterology 121: 91-100.
  13. Donnelly, K.L., Smith, C.I., Schwarzenberg, S.J., Jessurun, J., Boldt, M.D. and Parks, E.J. 2005. Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease. J Clin Invest., 115:1343-51.
  14. El-Maraghy, S.A., Rizk, S.M. and El-Sawalhi, M.M. 2009. Hepatoprotective potential of crocin and curcumin against iron overload-induced biochemical alterations in rat. African Journal of Biochemistry Research, 3(5):215-221.
  15. Farrell, G.C. 2003. Non-alcoholic steatohepatitis: what is it, and why is it important in the Asia-Pacific region?, Journal of Gastroenterology and Hepatology 18:124-138.
  16. He, S.Y., Qian, Z.Y., Tang, F.T., Wen, N., Xu, G.L. and Sheng, L. 2005, Effect of crocin on experimental atherosclerosis in quails and its mechanisms, Life Sciences, 77: 907-921.
  17. Hokanson, J.E. 2002. Hypertriglyceridemia and risk of coronary heart disease, Curr. Cardiol. Rep. 4: 488-493.
  18. James, O. and Day C. 1999. Non-alcoholic steatohepatitis: another disease of affluence, Lancet, 353:1634-1636.
  19. Kametani, T., Koshida, H., Nagaoka, T. and Miyakoshi, H. 2002. Hypertriglyceridemia is an independent risk factor for development of impaired fasting glucose and diabetes mellitus: a 9-year longitudinal study in Japanese, Intern. Med., 41:516-521.
  20. Kind, P.R. and King, E.J. 1954. Estimation of plasma phosphates by determination of hydrolyzed phenol with antipyrin. J. Clin. Pathol., 7:322-326.
  21. Koteish, A. and Diehl, A.M. 2002. Animal models of steatohepatitis, Semin. Liver Dis., 21:89-104.
  22. Lee, G. and Luna, H.T. 1988. Manual of histologic staining methods of the armed forces institute of pathology. Third Edition. The Blakiston Division Mc Graw. Hill Book Company, pp: 32- 107.
  23. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. and Randall, R.J. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193: 265-275.
  24. Magesh, V., Singh, J.P.V., Selvendiran, K., Ekambaram, G. and Sakthisekaran, D. 2006. Antitumour activity of crocetin in accordance to tumor incidence, antioxidant status, drug metabolizing enzymes and histopathological studies, Molecular and Cellular Biochemistry, 287: 127-135.
  25. Malloy, H.T. and Evelyn, K.A. 1937. The determination of bilirubin level with the photoelectric colorimeter. J. Biol. Chem., 119: 481-484.
  26. Ochiai, T., Ohno, S., Soeda, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. and Shimeno, H. 2004. Crocin prevents the death of rat pheochromocytoma (PC-12) cells by its antioxidant effects stronger than those of α-tocopherol, Neuroscience Letters, 362:61-64.
  27. Orrenius, S., Gogvadze, V. and Zhivotovsky, B. 2007. Mitochondrial oxidative stress: implications for cell death, Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 47:143-183.
  28. Postic, C. and Girard, J. 2008. Contribution of de novo fatty acid synthesis to hepatic steatosis and insulin resistance: lessons from genetically engineered mice. J Clin Invest.,118:829-38.
  29. Reitman, S. and Frankel, S. 1957. A colorimetric method for the determination of serum glutamic oxaloacetic and glutamic pyruvic transaminase. Am. J. Clin. Pathol., 28:56-63.
  30. Shen, X.C. and Qian, Z.Y. 2006. Effects of crocetin on antioxidant enzymatic activities in cardiac hypertrophy induced by norepinephrine in rats. Pharmazie, 61:348-352.
  31. Sheng, L., Qian, Z., Zheng, S. and Xi, L. 2006. Mechanism of hypolipidemic effect of crocin in rats: Crocin inhibits pancreatic lipase. European Journal of Pharmacology, 543 (1-3): 116-122. 
  32. Tseng, T.H., Chu, C.Y., Huang, J.M., Shiow S.J. and Wang, C.J. 1995. Crocetin protects against oxidative damage in rat primary hepatocytes, Cancer Letters, 97:61-67.
  33. Walldius, G., Aastveit, A. and Jungner, I. 2004. Hypercholesterolemia and hypertriglyceridemia—greatest cardiac risk in subjects with high apoB/apoA-I levels, Int. Congr. Ser., 1262: 203-206.
  34. Wang, J.Q., Li, J., Zou, Y.H., Cheng, W.M., Lu, C., Zhang, L., Ge, J.F., Huang, C., Jin, Y., Lv, X.W., Hu, C.M. and Liu, L.P. 2009. Preventive effects of total flavonoids of Litsea coreana leve on hepatic steatosis in rats fed with high fat diet. Journal of Ethnopharmacology, 121(1):54-60.
  35. Xiang, M., Qian, Z.Y., Zhou, C.H., Liu, J., Li, W.N. and Li, W.N. 2006. Crocetin inhibits leukocyte adherence to vascular endothelial cells induced by AGEs. Journal of Ethnopharmacology, 107:25-31.
  36. Zou, Y., Li, J., Lu, C., Wang, J., Ge, J., Huang, Y., Zhang, L. and Wang, Y. 2006. High-fat emulsion-induced rat model of nonalcoholic steatohepatitis, Life Sciences, 79:1100-1107.