بررسی ژنتیکی مقاومت به آمانتادین در ویروس آنفلوانزای H9N2 پرندگان در ایران بین سال های 1377 تا 1388

نوع مقاله: علمی پژوهشی

چکیده

در سال 1377 یک اپیدمی از آنفلوانزای پرندگان در ایران شیوع پیدا نمود که عامل بسیاری از تلفات در مرغداری­های ایران گشت. تحقیقات به­عمل آمده نشان داد که عامل پیدایش این همه­گیری، ویروس آنفلوانزای پرندگان با تحت تیپ H9N2 می­باشد. به جهت درمان و پیشگیری عفونت­های ناشی از ویروس­های آنفلوانزای A در جهان، داروهای ضد آنفلوانزای آمانتادین و ریمانتادین (آدامانتان­ها) مورد استفاده قرار می­گرفتند که با افزایش مقاومت ویروس آنفلوانزا در برابر این داروها در سال­های اخیر استفاده از آنها محدود گردیده است. در یک بررسی مقایسه­ای بین سال­های 1377 تا 1388 در ایران، به جهت ارزیابی مقاومت به آمانتادین در ویروس­های آنفلوانزای A پرندگان تحت تیپ H9N2 تحقیقات خود را بر ساختار ژنتیکی ویروس، جائی­که آمانتادین بیشترین اثر خودرا روی کانال پروتئینی M2برجای می­گذارد، معطوف نمودیم. دو گروه ویروس آنفلوانزای پرندگان با تحت تیپ H9N2 مشتمل بر پنج نمونه ویروس مورد بررسی، مربوط به دو دوره زمانی (1385-1377 و 1388-1386) در تخم مرغ جنین­دار جداسازی شدند، سپس تحت آزمایشات واکنش­های زنجیره­ای پلیمراز به روش نسـخه بـرداری معکوس (RT-PCR) و الکتروفورز بر روی ژل آگاروز قرارگرفته و جهت تعیین توالی فرستاده شدند. تحلیل توالی ژنی پروتئین ماتریکس M2 نشان می­داد که در قسمت­های مجزا ازاین توالی، تعویض اسیدهای آمینه نسبت به توالی مورد توافق رخ داده است و کلیه جدایه­های مقاوم، جهش­های نقطه­ای سرین به آسپارژین (S31N) را که در جایگاه 31 منجر به مقاومت به آمانتادین می­شود، در برداشتند. در بررسی که جهت تعیین آگاهی از تاثیرپذیری ویروس­های آنفلوانزای پرندگان به آمانتادین صورت گرفت مقاومت به آمانتادین در ویروس­های آنفلوانزای پرندگان تحت تیپ H9N2 در ایران در سال­های 1386 تا 1388 گزارش شد. از این رو توصیه می­گردد جهت درمان و پیشگیری عفونت­های ناشی از ویروس­های آنفلوانزای پرندگان تحت تیپ H9N2 در مزارع، مصرف خودسرانه آمانتادین صورت نپذیرد. همچنین به نظر می­رسد آزمایشات عملی تأثیرپذیری دارو در شرایط درون تنی نیز، می­تواند متضمن استعمال مؤثر آن دارو گردد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Genetical Evaluation of resistance to amantadine in H9N2 Avian influenza virus in Iran between 1998 to 2009

چکیده [English]

Spread of an epidemic of avian influenza in 1998 in Iran was the cause of many deaths on farms. Research shows that made the emergence of this epidemic of avian influenza virus subtype H9N2. Anti-influenza drugs amantadine and rimantadine (Adamantane) were used for the treatment and prevention of infections caused by influenza A virus, but the use of these medications has been limited in recent years with increased resistance in the world. In a comparative study between the years 1998 to 2009 in Iran, to evaluate resistance to amantadine, the avian influenza A virus of subtype H9N2, we focused our research on the genetic structure of viruses, amantadine where most of their leaves left on the channel protein M2. Two groups of avian influenza A virus H9N2 subtype, were isolated in eggs with embryos, including five samples of the virus to two periods (1998-2006 and 2007-2009), then were the polymerase chain reaction tests using reverse transcription (RT-PCR) and electrophoresis on agarose gel and were sent for sequencing. The M2 sequence analysis displayed in different separate parts of this sequence as to consensus sequence that was amino acid changes together. And all of resistant isolates contained the point mutations (Ser to Asn) S31N at position 31 that could confer resistance to amantadine. The study took place, to determine the effectiveness of awareness of avian influenza viruses to amantadine, was reported, amantadine resistance in H9N2 subtype avian influenza viruses in the years 2007 and 2009 in Iran. Therefore, it is recommended to avoid the arbitrary use of amantadine to treat and prevent infections from avian influenza viruses of H9N2 subtype in the farms. Furthermore, it seems practical tests of the drug influence invivo, can ensure effective use of the drug.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Amantadine resistance
  • Avian influenza A virus
  • H9N2 subtype
  • Matrix protein M2

مقدمه

 

   آنفلوانزا یکی از شایع­تـرین و مهم­ترین عفـونت­های ویروسی می­باشد. آنفـلوانزای A، باعث اپیـدمی و حتی پاندمی­های شدید بیماری­های حاد تنفسی کشنده می­باشد که سالیانه باعث مرگ و میر و تلفات انسانی و حیوانی[1] می­گردد (3 و 20). در آخرین پاندمی که به­واسطه ویروس آنفلوانزای خوکی H1N1 در دنیا بوقوع پیوست، به نقل از مرکز جهانی کنترل دارو و پیشگیری [2] از 61 میلیون بیمار در سال2010-2009 در جهان، 470/12 نفر جان باختند (6). ویروس­های آنفلوانزا جزء خانواده ارتومیکسو ویروس­ها[3] هستند که دارای 5 جنس به نام­های آنفلوانزای C ,B ,A ، توگوتویروس[4] و آیزاویروس[5] می­باشند (13 و 20). ویریون­های آنفلوانزا ، چند شکلی بوده و به­صورت لوله­ای یا کروی دیده می­شوند. پوشش خارجی[6] ایـن ویروس دارای دو گلیکوپروتئین سطحی، هماگلوتینین (HA) و نورآمینیداز (NA) بوده و درون آن، پروتئین­های ماتریکس(M1) و غشائی (M2) قراردارند. ژنوم ویروس­های آنفلوانزای  Aو B از 8 قطعه متفاوت و مارپیچی نوکلئوکپسید تشکیل شده است که هرکدام از آنها، دارای RNA با سنس منفی، نوکلئوپروتئین و ترانس کریپتاز می­باشند (3). پروتئین M2، یک پروتئین تترامری سراسری غشاء می­باشد، که یک کانال یونی را در سمت پوششی ویروس آنفلوانزا ایجاد می­کند. کانال، خود یک هوموتترامر متشکل از چهار واحد کاملاً همسان (M2) می­باشد. زیر واحدهای مارپیچ به­وسیله دو باند دی­سولفید به­هم متصل شده و به­وسیله pH پائین ( pHاسیدی) فعال می­گردند. مشخص شده است که پروتئین M2 یک کانال یونی تنظیم کننده اسیدیته است و نقش بزرگی در انتقال و جریان یافتن پروتن از اندوزوم اسیدی بدرون ویروس، جهت تفکیک پروتئین ماتریکس M1 از ریبونوکلئوپروتئین(RNP) دارا می­باشد. به بیان دیگر پروسه پوشش برداری[7] را ایجاد نموده و انتشار را افزایش می­دهد (16 و 18). پروتئین M2 از سه زیر واحد پروتئینی شامل: انتهای [8]N و در معرض با محیط خارج،  ناحیه تراغشائی[9] که آبگریز
می­باشد و انتهای[10]C، متمایل به سمت درون ذره ویروسی تشکیل شده است. چهار مارپیچ تراغشائی که به­طور بسیار محکم به­هم بسته شده­اند، یک کانال دراز و باریکی را ایجاد می­کنند، که در آن His37 گیرنده pH بوده وTrp41 به­عنوان دروازه یا دریچه عمل می­کند. مارپیچ­های تراغشائی در میان چهار مارپیچ متمرکز شده با یک زاویه پیچش چپگرد در حدود 23 درجه تجمع می­یابند و سوراخ منفذ را تشکیل می­دهند. مارپیچ­های تراغشائی در یک انتها به­وسیله دی­سولفیدهای N-terminal و در انتهای دیگر به­وسیله انتهای C-terminal گسترش یافته­اند. مدل­های ساختاری زیادی از این کانال بر اساس آنالیز توالی جهش­زائی و تصویربرداری با رزونانس مغناطیسی[11] سه بعدی، ساخته شده است. بر اساس تصویر برداری NMR مشخص شده است که Val27، Ala30 وGly34  سطح پوشش منفذ را تشکیل می­دهند، بلکه Leu26، Ser31  و Leu38 در فشرده­سازی مارپیچ-مارپیچ تراغشائی، به­عنوان میانجی عمل می­کنند (18).  نتایج نشان می­دهند که موتاسیون S31N گردهمائی و تجمع تترامری کانال را به شدت کاهش می­دهد. موتاسیون­های ایجاد کننده مقاومت، بسته بندی مارپیچی ناحیه تراغشائی را سست نموده و ناهمگنی ساختاری را در حالت بسته شده افزایش می­دهد. موتاسیون S31N فشرده سازی مارپیچی TM را سست نموده و در نتیجه دارو کانال را از هم گسیخته می­کند. بالنتیجه، میل ترکیبی دارو مادامیکه فعالیت کانال محافظت شده است، به­طور چشمگیری کاهش می­یابد و مقاومت به آمانتادین را القاء می­نماید (16).

داروهای پایۀ آدامانتان، آمانتادین و ریمانتادین، که هدفی برای کانال M2 می­باشند، به­عنوان اولین انتخاب داروهای ضد ویروسی بر علیه شیوع جمعی ویروس­های آنفلوانزای A برای سال­های متمادی مورد استفاده قرار می­گرفتند، اما اخیراً مقاومت به آدامانتان­ها گسترش یافته است (8، 10 و 18). آمانتادین همانندسازی ویروس­های آنفلوانزای A  را به­وسیله ممانعت از پوشش برداری ویروس، در درون سلول مانع می­شود. همانند ریمانتادین، یک مهارکننده کانال یونیM2  می­باشد، که کانال یون تشکیل شده به­وسیله پروتئین ماتریکسM2  را سد می­کند (11). جهش­های مشخصی که در مقاومت به آمانتادین در ژن M2 نقش دارند، جهش­هایی را شامل می­شوند که در جایگاه­های اسید آمینه L26F، V27A، A30T، S31N، G34E وL38F   ایجاد می­گردند (1 و 18).

اگر چه ویروس­های آنفلوانزای پرندگان، معمولاً انسان را آلوده نمی­کند، موارد نادری از آلودگی انسان با ویروس آنفلوانزای پرندگان گزارش شده است. اغلب عفونت­های انسانی که با ویروس آنفلوانزای مرغی رخ داده است پس از تماس مستقیم با پرندگان آلوده صورت گرفته است. از نوامبر سال 2003 ، حدود 400 مورد عفونت انسانی با آنفلوانزای پرندگان توسط بیش از دوازده کشور در آسیا، آفریقا، اقیانوس آرام، اروپا و شرق نزدیک منتشر شده است. سازمان بهداشت جهانی[12]، اغلب موارد انسانی ابتلا به ویروس آنفلوانزای پرندگان را نتیجه تماس مستقیم با پرندگان بیمار یا مرده آلوده گزارش می­نماید (4). مطالعات انجام شده نشان می­دهند که برخی از داروهای ضدویروسی که برای ویروس آنفلوانزای انسانی تأیید شده­اند در درمان عفونت آنفلوانزای پرندگان در انسان­ها نیز کارآمدند. با این حال، ویروس­های آنفلوانزا می­توانند به این داروها مقاوم باشند، بنابراین این داروها ممکن است همیشه مؤثر واقع نشوند. مطالعات بیشتر برای نشان دادن تأثیر این داروها مورد نیاز می­باشد که در هنگام شناسایی عامل بیماری آنفلوآنزای پرندگان، جهت درمان ویروس­ها باید مورد تست حساسیت به داروهای ضد ویروس آنفلوانزا قرار گیرند (5). جلوگیری از مقاومت داروئی و همچنین ممانعت از تشکیل تیپ­های جدید مقاوم به دارو در ویروس­های آنفلوانزای نوع A پرندگان در سطح مراکز بهداشتی درمانی و طبعاً گسترش و شیوع آن در جامعه از عواملی بود که ما را بر انجام این تحقیق معطوف نمود. از ضرورت­های خاص انجام این تحقیق، با مشخص شدن مقاومت یک ویروس آنفلوانزا به یک دارو، این است که بایستی از مصرف و استعمال آن خودداری گردد، بدین جهت که اکثر تحت تیپ­های آنفلوانزا مشترک بین انسان و حیوان
می­باشند و این تحت تیپ که لطمات مؤثری بر گله­های طیور وارد می­آورد، از هزینه بالائی که صاحبان مرغداری­ها جهت خرید داروی مقاوم شده صرف می­نمایند، ممانعت به عمل
می­آورد. همچنین از آن جهت که دائماً ویروس آنفلوانزا در حال تغییر ترتیب ژنی می­باشد از مقاوم شدن تحت تیپ­های دیگر ویروس نسبت به دارو جلوگیری بعمل خواهد آمد.

در سال 1377 در ایران آنفلوانزای پرندگان شیوع پیدا نمود که لطمات اقتصادی بالائی به صنعت مرغداری کشور وارد آورد، در جداسازی­های صورت گرفته، عامل موثر، زیر گونه با بیماری­زائی اندک H9N2 شناخته شد. در طول دوره زمانی 1998-1994، زیر گونه H9N2 در دیگر نقاط جهان نیز به­طور قابل توجهی شیوع پیدا نمود (14، 15 و 17). در این بررسی سعی شد تا توالی­های اسید آمینه و نوکلئوتیدی پروتئین ماتریکس M2 از ویروس­های جدا شده در دو دوره زمانی (1385-1377و 1388-1386) پنج تحت تیپ H9N2 در ایران از نظر حساسیت و یا مقاومت به داروی ضد ویروس آمانتادین مورد بررسی قـرار گیرند.

 

مواد و روش­ها

     نمونه­های ویروسی: 5 نمونه ویروس از بخش علوم درمانگاهی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، با مشخصات آورده شده در (جدول 1) اخذ گردید. نمونه‌ها مربوط به گله‌های گوشتی مرغداری­های استان تهران و حومه بودند که در طی سالهای 1377 تا 1388 جداسازی گردیدند.

جداسازی ویروس: دو گروه ویروس آنفلوانزای پرندگان با تحت تیپ H9N2 مشتمل بر پنج نمونه ویروس مورد بررسی، مربوط به دو دوره زمانی (1385-1377و 1388-1386) در تخم مرغ جنین دار جداسازی شدند. نمونه­های دوره زمانی اول (1385-1377) که به صورت ذخیره[13] در بانک ویروس بخش علوم درمانگاهی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران در 70- درجه سلسیوس نگه­داری شده بودند، جهت تعیین تیتر ویروس مورد آزمایش هماگلوتیناسیون[14] قرارگرفتند. نمونه­های دوره زمانی دوم (1388-1386) نیز که از بافت نای و ریه گله‌های گوشتی مرغداری­های استان تهران و حومه تهیه و آماده سازی شده بودند، در کیسه آلانتوئیک تخم مرغ جنین دار 10 روزه تلقیح گردیدند. از تخم مرغ­های تلقیح شده نیز، آزمایش HA و تعیین تیتر ویروس، صورت گرفته شد. سپس نمونه­های با تیتر آنتی ژنی مناسب جهت انجام بررسی­های مولکولی بعدی مورد استفاده قرار گرفتند.

استخراج RT-PCR ,RNA  : RNA ویروس­های جدا شده از مایع آلانتوئیک به­وسیله کیت High Pure Viral Nucleic Acid Kit ( Rocheآلمان) با (Cat. No. 11 858 874 001) مطابق دستورالعمل شرکت سازنده استخراج شدند و واکنش زنجیره­ای پلیمراز به روش نسـخه بـرداری معکوس[15] از روی RNA  ویروسی با استفاده از پرایمرهای طراحی شده
به­طور اختـصاصی جهت قطعه ژن M، صورت گـرفته شد. جهت انجام واکنش RT-PCR، از کیت Titan One Tube RT-PCR System (Roche آلمان) با (Cat. No. 11 855 476 001) مطابق دستورالعمل شرکت سازنده، در شرایط 1سیکل در (0c50 برای 30 دقیقه و 0c94 برای 2 دقیقه) و 35 سیکل در (0c94 برای 45 ثانیه ، 0c58 برای 1 دقیقه و 0c68 برای 1 دقیقه ) و 1 سیکل در (0c68 برای 10 دقیقه) استفاده گردید و یک جفت پرایمر (فرادست و فرودست) ساخت شرکت MWG آلمان مورد استفاده در این بررسی بدین شرح بود: M2UF: 5'(GGA ATT CCA TAT GAG TCT TCT AAC CGA G)3', (28)M2LR: 5'(GGA ATT CCT TAC TCC AGC TCT ATG TTG)3' (27).

توالی یابی و آنالیز داده­ها (Sequencing): محـصول PCR  نیـز پس از انجام آزمایش الکتروفورز بر روی ژل آگاروز 1%، به­وسیـله کیت Agarose Gel DNA Extraction Kit

( Rocheآلمان) با (Cat. No. 11 696 505 001) مطابق دستور العمل شرکت سازنده مورد پالایش قرارگرفت و نمونه­ها جهت تعیین توالی ژن به روش خوانش توالی دو طرفه (Comfort Read Sequencing) بـهMWG  آلمان ارسال گردید. نتایج توالی­ها با استفاده از نرم افزارهای بیوانفورماتیک MEGA4 و CLC Sequence Viewer 6 مورد ارزیابی قرار گرفتند. توالی­های به­دست آمده در بانک ژن (GeneBank) توسط برنامه BankIt ثبت گردیدند و شماره دستـرسی بـه آنها اختـصاص یافت که در (جدول2) آمده است.

یافته­ها

   محصول  PCR قطعات مورد نظر پس از رانش بر روی  ژل آگاروز 1%، مورد بررسی اولیه قرا گرفتند. طول  قطعات pb  1027 بودند. بر روی ژل پنج نمونه ویروسی کار شده  با  خط کش ژنی Lader 1000pb Fermentse   نشان داده شده است (نگاره 1). در این فرایند باند غیر اختصاصی دیده نشد که گویای بهینه نمودن مناسب واکنش زنجیره­ای پلی مراز می­باشد.

بررسی پروتئین ماتریکس M2: همان­طور که در (نگاره 2) و مقایسه کروماتوگرام جدایه­ها در (نگاره 3) نشان داده شده است، از نظر تبدیل نوکلئوتیدی مشخص می­شود که یک جهش
نقطه­ای در نوکلئوتید میانی در دو جدایه AS110, AS120 نسبت به سه جدایه AS123, AS130, AS133 از نوع ترانسورژن رخ داده است که در نتیجه آن در موقعیت 31، اسید آمینه سرین با اسید آمینه آسپارژین تعویض گردیده است. تنها برای تبدیل S به N و یا تبدیل نوکلئوتید  ‍G بهA  به ترتیب یک جهش نقطه­ای در جایگاه اسیدآمینه شماره 31 یا نوکلئوتید 92 لازم می­باشد (7 و 9).

بحث و نتیجه­گیری

     Yavarian و همکاران در دو بررسی (2010-2009) در ایران مقاومت به آمانتادین و ریمانتادین در سویه H3N2 در دو دوره 2007-2005 و 2008-2005 مورد بررسی قرار دادند. از 14 نمونه مورد بررسی، 10 نمونه از نوع جهش نقطه­ای در موقعیت 31 با تعویض اسید آمینه سرین به آسپارژین بود. در بررسی دوم نیز یاوریان و همکاران با جمع­آوری نمونه­هائی از نقاط مختلف ایران مقاومت به آمانتادین از نوع تعویض اسیدآمینه S31N را اذعان نمودند (21 و 22).Bai  و همکاران (2009) در تایلند مقاومت به آمانتادین را بین سال­های 2006 تا 2008 مورد بررسی قراردادند. از 66 نمونه مورد بررسی، 44 نمونه مربوط به تحت تیپ H1N1 و 22 نمونه مربوط به H3N2، از بانکوک و 11 استان دیگر بود که از این میان 22% ویروس­ها در سال 2006 مقاومت به آمانتادین را با تعویض S31N نشان می­دادند (2). در همان سال Huang و همکاران (2009) نیز از 17 جدایه H9N2 مورد بررسی، بین سال­های 2008-1998 در شمال چین با جداسازی مولکولی صورت گرفته، مقاومت به آمانتادین با تعویض S31N را گزارش نمودند (12). یک سال بعد Suzuki و همکاران (2010) در ژاپن با بررسی دو سویه H1N1 و H3N2 در سال 2008-2007 دریافتند که 62% از تحت تیپ H1N1 و 100% موارد تحت تیپ H3N2  با مدل S31N به آمانتادین مقاومت نشان می­دهند (19). تاکنون 670  توالی بر اساس پروتئین ماتریکسM2  از تحت تیپ H9N2 در دنیا تا سال 1389 در بانک ژن ثبت گردیده است. از 670 جدایه ثبت شده در بانک جهانی، تنها 73 جدایه (%84/10)، مقاوم به آمانتادین می­باشند که از این میان 5 جدایه (%6/84) از کل جدایه­های مقاوم از نوع جهش با تعویض اسید آمینه A30T بوده و 22 مورد (%30/13) از تعویض نوع V27A و 46 جدایه (%63/10) از نوع جهش با تعویض اسید آمینه S31N که بیشترین آمار را نشان می­دهد بودند.

با بررسی نتایج به­دست آمده از ماحصل تحقیقات منتشر شده از ایران و سایر نقاط جهان و بررسی درصد جهش­های جدایه­های مقاوم به آمانتادین به­دست آمده از بانک ژن، می­توان اینگونه نتیجه­گیری نمود که تعویض اسید آمینه سرین به آسپارژین در موقعیت 31 بیشترین و اصلی ترین عامل ایجاد کننده مقاومت به آمانتادین در ویروس­های آنفلوانزای A در تحت تیپ H9N2 و سایر تحت تیپ­ها باشد. لذا با بررسی­های انجام شده در این مطالعه، به نظر می­رسد که ویروس­های آنفلوانزای A تحت تیپ H9N2 در سال 1386 و 1388 از نظر ژنتیکی در مقایسه با ویروس فوق با همان تحت تیپ در سال­های1377، 1378 و 1385 با تعویض زیـر واحد آمینواسیدی در موقعیت S31N در ژنـوم پروتئین ماتریکس M2، مقاومت به آمـانتـادین را عـرضه می­نمایـند.

بر اساس برنامه CLUSTAL W  کل جدایه­های ثبت شده از ایران، بر اساس شاخص توالی اسید آمینه پروتئین ماتریکس M2 مورد بررسی میزان شباهت و تفاوت قرار گرفتند: در بین جدایه­های مورد بررسی در این مطالعه با جدایه­های ایران، بیشترین شباهت بین جدایه­های AS123 و AS130 (100 درصد) وجود داشت. همچنین کمترین تفاوت نیز بین جدایه AS120  با جدایه AS133 (94 درصد) وجود داشت. با توجه به نتایج به­دست آمده می­توان بیان نمود که ویروس­های ایران از سال 1386 به بعد دچار تغییراتی گشته­اند که باید به­دنبال علت این تغییرات بود، که نیازمند بررسی­های بیوانفورماتیکی بیشتر می­باشد.

در این بررسی سعی شد تا توالی­های ژن M2 از ویروس­های جدا شده در دو دوره زمانی (1385-1377و 1388-1386) در ایران مورد ارزیابی قـرار گیرند. در یک بررسی مقایسه­ای، پنج تحت تیپ H9N2 در ایـران مورد ارزیابی واقـع شدند و اطلاعات آنها در GeneBank ثبت گردیدند. آمینو اسیـدها در پروتئین ماتریکس M2 در نـاحیه تراغشائی، در جدایه­های سال­های 1377، 1378 و 1385 تعویض را  نشان نمی­دادند. در حـالی­که، در درگیری صورت گرفته در سال­های 1386 و 1388 تعـویض تک آمینو اسید اتفاق افتاده بود. با مقایسۀ آمینو اسیـدها در جـایگاه 31 مشاهده گردید که، اسید آمینه سرین (S) که در تـوالی مورد توافق در اپیدمی­های پیشین قرار داشت، در
اپیدمی­های جـدید به آسپارژین (N) جهش یافته بود، که در نتیجه منجر به مقاومت ویروس آنفلوانزای A نسبت به داروی ضـد ویروس آمانتادین گردید. بررسی­های ما احتمال مقاومت به آمانتادین را نشـان می­داد. به هر حال جهت شناسائی منشاء اصلی ویروس آنفلوانزای پرندگان با تحت تیپ H9N2 و شیوع یک دهه اخیر آن در سطح مرغداری­های ایران، نیاز به مطالعات فیلوژنتیک گسترده و همچنین بررسی جدایه های H9N2 ایران از نظر دودمانی بسیار مثمر ثمر به نظر می­رسد.

 

 

جدول 1- ویروس­های آنفلوانزای تحت تیپ H9N2 جداشده از جوجه­های گوشتی استان تهران در طی سال­های 1377 تا 1388.

 

 

 

جدول2- شماره دسترسی ویروس­های تحت تیپ H9N2 جداسازی شده در این مطالعه پس از ثبت در بانک ژن (NCBI)

 

 

 

 

 

 

نگاره 1- محصول PCR پنج جدایه ویروسی تحت تیپ H9N2 جداشده از جوجه­های گوشتی استان تهران در طی سال­های 1377 تا 1388.

(طول قطعه bp 1027)

ردیف 1:جدایه AS130، ردیف 2:جدایه AS120، ردیف 3:جدایه AS123، ردیف 4:جدایه AS133، ردیف 5:جدایه AS110، ردیف 6: خط کش ژنی (Lader 1000pb Fermentse  ).

 

 

 

 

 

 

 

نگاره 2- تغییر در توالی پروتئین ماتریکس M2 جدایه­های  آنفلوانزای تحت تیپ H9N2  جداسازی شده از جوجه­های گوشتی استان تهران درطی سال­های 1377، 1378، 1385، 1386 و 1388 با استفاده از نرم افزار CLC Sequence Viewer 6.

A: تغییر در توالی اسید آمینه پروتئین ماتریکس M2، B: تغییر توالی نوکلئوتیدی در پروتئین ماتریکس M2

 

 

 

نگاره 3- کروماتوگرام جدایه­های آنفلوانزای A تحت تیپ H9N2 جداسازی شده در این مطالعه از نظر تغییر نوکلئوتیدی در توالی پروتئین ماتریکس M2

 



[1] - Enzootic

[2] -Centers for Disease Control and Prevention (CDC)

[3] - Orthomyxoviridae

[4] - Togoto virus

[5] - Isavirus

[6] - Envelope

[7] - Uncoating

N-terminal-[8]

[9] - TransMembrane )TM)

C-terminal-[10]

[11] -(Nuclear Magnetic Resonance (NMR

[12]-World Health Organization (WHO)

[13] - Stock

[14] -Haemagglutination Assay  (HA)

[15] - Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)

  1. Abed, Y., N. Goyette, and G. Boivin. 2005. Generation and characterization of recombinant influenza A (H1N1) viruses harboring amantadine resistance mutations. Antimicrobial agents and chemotherapy 49:556.
  2. Bai, G. R., M. Chittaganpitch, Y. Kanai, Y. G. Li, W. Auwanit, K. Ikuta, and P. Sawanpanyalert. 2009. Amantadine- and oseltamivir-resistant variants of influenza A viruses in Thailand. Biochem Biophys Res Commun 390:897-901.
  3. Bauera, M. S. R. Z. K., A. Krumbholza, and C. S. J. S. P. Wutzlera. 2006. Amantadine resistance among porcine H1N1, H1N2, and H3N2 influenza A viruses isolated in Germany between 1981 and 2001. Intervirology 49:286-293.
  4. CDC. Centers for Diasease Control and prevention. Avian Influenza A Virus Infections of Humans. (Accessed May 23, 2008 , at http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/avian-flu-humans.htm).
  5. CDC. Centers for Disease Control and Prevention. Key Facts About Avian Influenza (Bird Flu) and Highly Pathogenic Avian Influenza A (H5N1) Virus. (Accessed November 21, 2010, at http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/facts.htm).
  6. CDC. Centers for Disease Control and Prevention. Updated CDC Estimates of 2009 H1N1 Influenza Cases, Hospitalizations and Deaths in the United States, April 2009 – April 10, 2010. (Accessed May 14, 2010, at http://www.cdc.gov/h1n1flu/estimates_2009_h1n1.htm).
  7. Cha, R. S., H. Zarbl, P. Keohavong, and W. G. Thilly. 1992. Mismatch amplification mutation assay (MAMA): application to the cH-ras gene. Genome Research 2:14.
  8. Furuse, Y., A. Suzuki, and H. Oshitani. 2009. Large-scale sequence analysis of M gene of influenza A viruses from different species: mechanisms for emergence and spread of amantadine resistance. Antimicrobial agents and chemotherapy 53:4457.
  9. Hata, M., M. Tsuzuki, Y. Goto, N. Kumagai, M. Harada, M. Hashimoto, S. Tanaka, K. Sakae, T. Kimura, H. Minagawa, and Y. Miyazaki. 2007. High frequency of amantadine-resistant influenza A (H3N2) viruses in the 2005-2006 season and rapid detection of amantadine-resistant influenza A (H3N2) viruses by MAMA-PCR. Jpn J Infect Dis 60:202-204.
  10. Hayden, F. G., and A. T. Pavia. 2006. Antiviral management of seasonal and pandemic influenza. Journal of Infectious Diseases 194:S119.
  11. Hu, J., T. Asbury, S. Achuthan, C. Li, R. Bertram, J. R. Quine, R. Fu, and T. A. Cross. 2007. Backbone structure of the amantadine-blocked trans-membrane domain M2 proton channel from influenza A virus. Biophysical journal 92:4335-4343.
  12. Huang, Y., B. Hu, X. Wen, S. Cao, D. Xu, X. Zhang, and M. I. Khan. 2009. Evolution analysis of the matrix (M) protein genes of 17 H9N2 chicken influenza viruses isolated in northern China during 1998-2008. Virus Genes 38:398-403.
  13. Kwon, H. J., S. H. Cho, Y. J. Ahn, J. H. Kim, H. S. Yoo, and S. J. Kim. 2009. Characterizationof a Chicken Embryo-Adapted H9N2 Subtype Avian Influenza Virus. Open Veterinary Science Journal 3:9-16.
  14. Marandi, M. V., and M. H. B. Fard. 2002. Isolation of H9N2 subtype of avian influenza viruses during an outbreak in chickens in Iran. Iranian Biomedical Journal 6:13-17.
  15. Nili, H., and K. Asasi. 2003. Avian influenza (H9N2) outbreak in Iran. Avian diseases 47:828-831.
  16. Pielak, R. M., J. R. Schnell, and J. J. Chou. 2009. Mechanism of drug inhibition and drug resistance of influenza A M2 channel. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 106:7379.
  17. Pourbakhsh, S., M. Khodashenas, M. Kianizadeh, and H. Goodarzi. 2000. Isolation and identification of avian influenza virus H9N2 subtype. ARCHIVES OF RAZI INSTITUTE 51:27-38.
  18. Schnell, J. R., and J. J. Chou. 2008. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature 451:591-595.
  19. Suzuki, Y., R. Saito, H. Zaraket, C. Dapat, I. Caperig-Dapat, and H. Suzuki. 2010. Rapid and specific detection of amantadine-resistant influenza A viruses with a Ser31Asn mutation by the cycling probe method. J Clin Microbiol 48:57-63.
  20. Wright, P. F., G. Neumann, Y. Kawaoka, D. Knipe, and P. Howley. 2007. Orthomyxoviridae. Fields Virology 5th edition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins:1691–1740.
  21. Yavarian, J., T. M. Azad, X. Zheng, V. Gregory, Y. P. Lin, and A. Hay. 2010. Amantadine resistance in relation to the evolution of influenza A(H3N2) viruses in Iran. Antiviral Res 88:193-196.
  22. Yavarian, J., T. Mokhtari Azad, N. Z. Shafiei Jandaghi, and R. Nategh. 2009. Amantadine-resistant influenza A (H3N2) viruses in Iran. Acta Virol 53:135-138.