اثرات پیشگیرانه سترورلیکس بر تغییرات ایجاد شده توسط سیسپلاتین بر سلول‌های اسپرماتوژنیک، میوئید و بازال لامینای مجاری سمینی‌فر در بیضه موش نژاد Balb/C

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

1 مرکز تحقیقات کار بردی دارویی، استادیار دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران

2 گروه علوم تشریح، دانشکده پزشکی، استاد دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران

3 گروه علوم تشریح، دانشکده پزشکی، استادیار دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران

چکیده

سیسپلاتین به­عنوان یک داروی موثر در شیمی­درمانی می­تواند اثرات سوء در اسپرماتوژنز داشته باشد. از طرف دیگر اسپرماتوژنز تحت تاثیر هورمون­های گنادوتروپین (LH وFSH) می­باشد. به­نظر می­رسد، موقع شیمی­درمانی بتوان با سرکوب ترشح LH  و FSH موجب توقف اسپرماتوژنز گردید و به این ترتیب این سلول­ها را در برابر اثرات سوء سیسپلاتین حفظ کرد. سترورلیکس (آنتاگونیستGnRH ) برای توقف ترشح گنادوتروپین­ها مورد استفاده قرار می­گیرد. در این تحقیق سعی شده است توانایی داروی سترورلیکس در مهار اثرات سوء سیسپلاتین  بر اپیتلیوم لایه ژرمینال بیضه بررسی گردد. در این مطالعه 30  سر موش نر بالغ 8-6 هفته­ای Balb/C به­طور تصادفی به 3 گروه 10تایی تقسیم شدند. گروه 1 به عنوان شاهد سالم در نظر گرفته شد و هیچ دارویی دریافت نکرد. گروه آزمایش 1 سیسپلاتین را روزانه به مقدار bw/ mg/kg5/2 به­صورت داخل صفاقی به مدت 5 روز دریافت کرد. در گروه آزمایش 2 تزریق سترورلیکس هفته­ای سه بار به­صورت زیر جلدی هر بار به میزان mg/kg/bw 25/0 انجام شد که یک هفته قبل از تزریق سیسپلاتین شروع و در هفته­های دوم (همراه با سیسپلاتین) و سوم نیز ادامه یافت. بعد ازگذشت 35 روز از آخرین تزریق از بیضه­ها برای مطالعه هیستولوژی، هیستوشیمی و میکروسکوپ الکترونی نمونه­برداری شد. نتایج توسط آزمون آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی توکی مورد تحلیل آماری قرار گرفتند. نتایج هیستولوژی نشان داد که در گروه دریافت کننده سیسپلاتین هسته سلول­های اسپرماتوگونی متراکم­تر و قطر لوله­های سمینی­فر نسبت به گروه شاهد کاهش یافته است و در برخی از لوله­ها فقط سلول­های سرتولی مشاهده می­شدند. مطالعه هیستوشیمیایی این گروه نشان داد که تعداد سلول­های آپوپتوتیک در این گروه افزایش یافته است. مطالعه با میکروسکوپ الکترونی نیز نشان­دهنده غشاء پایه موجی شکل و نامنظم لوله­های سمینی­فر به همراه سلول­های میوئید ضخیم و در حال انقباض بود. در گروه آزمایش 2 سترورلیکس تا حدود زیادی اثرات سوء سیس­پلاتین را مهار کرده بود. نتایج این مطالعه نشان داد تزریق سترورلیکس همراه با سیسپلاتین سلول­های اسپرماتوژنیک را از اثرات سوء سیس­پلاتین حفاظت می­کند.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Preventive effects of Cetrorelix on the changes induced by Cisplatin on spermatogenic and myoid cells and basal lamina of seminiferous ducts in the testis of Balb/C mouse

نویسندگان [English]

  • dariyoush mohammadneja 1
  • jafar soleymanirad 2
  • ameneh mohammadiroshandeh 3
چکیده [English]

Cisplatin used in chemotherapy can have side effect on spermatogenesis. As it is known Gonadotropine hormones (LH, FSH) affect spermatogenesis. It seems by suppressing secretion of LH and FSH during chemotherapy, spermatogenesis could stopped which could result in protection of the cells from cisplatin side effects. The aim of the present study is to investigate the preventive effect of cetrorelix (GnRH antagonist) on spermatogenic defect produced by Cisplatin. In the present study thirty adult male mice aging 6-8 weeks were divided into 3 groups as: Control, Experimental 1 and Experimental 2. Experimental 1 received Cisplatin for 5 days as 2.5 mg/kg intraperitoneally and Experimental 2 received 0.25 mg/kg cetrorelix (GnRH antagonist) one week before cisplatin treatment and continued for 3 weeks. After 35 days from last injection, testicular specimens were removed and prepared for light and electron microscopic study. The data were analyzed using ANOVA (Tukey) in all 3 groups. Histological results showed that nucleus of spermatogonia cells were more condensed and diameter of seminiferous tubules were reduced, in the group which received cisplatin in comparison with the control group. Histochemical studies showed an increase of apoptotic cells in the group which received cisplatin. Electron microscopy showed that in Experimental 1 group basment membrane was morphologically irregular and wavey and Myoid cells were thickened and contracted, but in Experimental 2 group the condition was similar to the control group. These results showed that injection of cetrorelix with cisplatin can protect spermatogenic cells against the side effects of cisplatin.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cisplatin
  • Cetrorelix
  • Spermatogenes
  • Myoid cell
  • Basal lamina

مقدمه    

    اختلال در تولید اسپرم و آسیب در روند اسپرماتوژنز از
شایع­ترین علل ناباروری مردان به شمار می­رود. از جمله عواملی که موجب اختلال در اسپرماتوژنز می­گردد، داروهای مورد استفاده در شیمی درمانی هستند. این داروها در از بین بردن سلول­های سرطانی که سریعاً تقسیم می­­شوند، بسیار موثر
می­باشند ولی متاسفانه این داروها توانایی تشخیص تقسیم در سلول­های سالم و سرطانی را ندارند لذا وقتی که مورد استفاده قرار می­گیرند علاوه بر سلول­های سرطانی، سلول­های سالم بدن که سرعت تقسیم بالایی دارند، از جمله اسپرماتوژنز را هم مورد هدف قرار می دهند (2008 Nejad,). اسپرماتوژنز تحت تأثیر عوامل مختلفی از جمله رادیوتراپی و شیمی­درمانی قرار دارد. یکی از داروهایی که در درمان انواع مختلفی از تومورها استفاده می­شود، سیسپلاتین می­باشد. سیسپلاتین  از جمله داروهای شیمی درمانی موثر در درمان  بسیاری از تومورهایی همچون سرطان بیضه، تخمدان، ریه، مثانه و لنفوم­ها می­باشد. این دارو الکیله کننده نیست اما خاصیت الکیله­کنندگی دارد و موجب تغییرات بیوشیمیایی و بافتی  در بیضه از جمله اپیتلوم  ژرمینال می­گردد (Thohda et al., 2001; Meistrich et al., 1998; Spermon et al., 2006; Helm and States, 2009; Kazumasa et al., 2002; Seaman et al., 2003; Velasquez et al., 1988; Sawhney et al., 2005; Aminsharifi et al., 2010  ).

Turk و همکاران در سال 2007 نشان دادند که سیسپلاتین موجب کاهش وزن بیضه ،اپیدیدیم و وزیکول سمینال در موش­های صحرایی می­شود (Turk et al., 2007). در مورد نحوه آسیب رساندن این داروها بر روند اسپرماتوژنز مکانیسم­های گوناگونی مطرح شده که از جمله مهمترین آنها آپوپتوز و شکست زنجیره DNA است (Bar-Shira et al., 2004). آپوپتوز مرگ برنامه­ریزی شده سلولی می­باشد که در سلول­ها و بافت­های مختلف بدن، هم در زندگی جنینی و هم بعد از تولد انجام می­گیرد (Roberts, 2000). مطالعات متعدد  نشان داده است که از بین رفتن سلول­ها به دنبال شیمی درمانی در اثر القاء آپوپتوز انجام می­گیرد (Kasper et al., 2005; Bibin et al., 2004; Bakalska et al., 2004; Habermehl et al., 2006; Hou et al., 2005). Koberle و همکارانش نیز در سال 2010 نشان دادند که پدیده اتصال متقاطع بین رشته­ای (Interstrand cross linked) مهمترین عامل سیتوتوکسیک است که به­وسیله سیسپلاتین القاء می شود (Koberle et al., 2010).

Seaman در سال 2013 نشان داد که اثرات سمی سیسپلاتین از طریق القاء آسیب سلول­های سرتولی ایجاد می­شود که در نهایت موجب آسیب سلول­های جنسی می­گردد (Seaman et al., 2003). با وجود استفاده وسیع از سیسپلاتین  در شیمی درمانی، در مورد چگونگی حفظ اسپرماتوژنز از اثرات سوء آن مطالعات اندکی وجود دارد و بدیهی است که روش­های پیشگیری از اثرات سیتوتوکسیک سیسپلاتین بر باروری و حفظ عملکرد گنادها پس از شیمی درمانی در مردان و زنان به­ویژه در سنین باروری بسیار ضروری است .

برای اولین بارGlode  و همکارانش در سال 1981 بیان داشتند که می­توان در موقع شیمی­درمانی با اختلال در محور هیپوتالاموس– هیپوفیزی،LH  وSH  را کاهش داد و با این عمل موجب بهبودی اسپرماتوژنز بعد از قطع شیمی­درمانی شد (Glode et al., 1981). برای مهار محور هیپوتالاموس-هیپوفیزی روش­های مختلفی وجود دارد از جمله، استفاده از آنالوگ­ها و یا آنتاگونیست­های GnRH  (Spermon et al., 2006; Aminsharifi et al., 2010; Behre et al., 1992; Meistrich et al., 2001; Meistrich et al., 1995; Howell and Shalet, 2005 ). از آنتاگونیست­های GnRH که امروزه کاربرد وسیع دارد، سترورلیکس را می­توان نام برد. این دارو یک دکاپپتید می­باشد که با مهار ترشح   LH وFSH از طریق تاثیر بر هیپوفیز تقسیم اسپرماتوگونی­ها را متوقف کرده و در نهایت موجب حفاظت سلول­های بنیادی بیضه در برابر اثرات سوء داروهای مورد استفاده در شیمی درمانی می­شود چرا که این داروها به سلول­هایی که دارای تقسیمات سریع هستند، مانند اسپرماتوگونی­ها، آسیب می­رسانند (Cook et al., 2000; Tevor et al., 2002; Anderson et al., 2002; Grundker et al., 2004).

علی­رغم مورد توجه قرار گرفتن آنتاگونیست­های گنادوتروپین در کاهش اثرات مخرب داروهای ضد سرطان اطلاعات کمی در مورد اثرات ترمیمی آنها در آسیب­های ایجاد شده توسط سیسپلاتین وجود دارد. در این مطالعه سعی شده است اثرات حمایتی سترورلیکس به عنوان آنتاگونیست GnRH در مهار تخریب سلول­های بنیادی بیضه توسط سیسپلاتین، به­ویژه در سطح فراساختاری مورد بررسی قرار گیرد.

مواد و روش­ها

    در این مطالعه از 30 سر موش نر نژاد  balb/c   با محدوده سنی 8-6 هفته و میانگین وزنی  2±29 گرم که از انستیتو پاستور کرج خریداری شده بود، استفاده گردید. این موش­ها در شرایط استاندارد و دمای حدود 22 درجه سانتی­گراد و تحت شرایط یکسان چرخه نوری دوازده ساعت روشنایی و دوازده ساعت تاریکی و با دسترسی آزاد به آب و غذا نگه داری
می­شدند. کلیه مراحل آزمایش تحت نظر کمیته نظات بر حقوق حیوانات آزمایشگاهی مرکز تحقیقات کار بردی دارویی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز انجام گرفت. داروی سیس­پلاتین از شرکت Eber و داروی سترورلیکس از شرکت Serono و کیت تانل از شرکت Roche خریداری شد. در این مطالعه موش­ها به طور تصادفی در 3 گروه برابر تقسیم شدند. گروه اول به عنوان شاهد سالم در نظر گرفته شد و هیچ دارویی دریافت نکرد. گروه آزمایش 1 که فقط داروی سیسپلاتین را به مقدار bw/ mg/kg 5/2 به مدت 5 روز به­صورت داخل صفاقی دریافت کرد. گروه آزمایش 2 سیسپلاتین را به همراه سترورلیکس (cetrorelix) آنتاگونیستGnRH  دریافت کرد. تزریق سترورلیکس هفته­ای سه بار به­صورت زیر جلدی هر بار به میزان mg/kg/bw  25/0 انجام شد که یک هفته قبل از تزریق سیسپلاتین شروع و در هفته­های دوم (همراه با سیسپلاتین) و سوم نیز ادامه  یافت.

بعد از گذشت 35 روز از آخرین تزریق، موش­ها با جابجایی مهره­های گردن به راحتی کشته شدند و از بیضه راست جهت نمونه­برداری استفاده شد که به آرامی با یک تیغ تیز به دو نیمه تقسیم شد. نصف بافت بیضه برای مطالعه کمی به مدت 48 ساعت داخل محلول پایدار کننده بوئن و نصف دیگر آنها به مدت 48 ساعت داخل محلول فرمالین 10% برای مطالعه هیستوشیمیایی قرار داده شد. از نمونه­های پایدار شده توسط بوئن، پس از پاساژ بافتی و قالب­گیری مقاطع 5 میکرونی تهیه و پس از رنگ آمیزی پریودیک اسید شیف (PAS) مورد مطالعه قرار گرفتند.

جهت اندازه­گیری قطر لوله­های سمینی­فر از نرم­افزار Motic Image plus 2.0 استفاده گردید. برای تعیین قطر لوله­ها، با عدسی 10× اقطار کوچک و بزرگ 20 لوله سمینی­فر در مقطع عرضی از هر نمونه اندازه­گیری و سپس تمامی داده­های کمی به­دست آمده به­وسیله آزمون آماریANOVA  و پس آزمون Tukey با استفاده از نرم افزار SPSS.13 مورد واکاوی آماری قرار گرفتند. در این مطالعه 05/0p<  معنی­دار تلقی گردید. برای مطالعه سلول­های آپوپتوتیک از نمونه­های پایدار شده در فرمالین بافری 10% پس از پاساژ و قالب­گیری، برش­های 2 میکرونی تهیه و پس از پارافین­زدایی به مدت 5 دقیقه در بافر سیترات سدیم 1/0 مولار انکوبه شدند. رنگ­آمیزی اختصاصی تانل برای سنجش فراگمانتاسیون DNA جهت مشخص کردن سلول­های آپوپتوتیک با استفاده از دستورالعمل کیت تانل طبق پروتکل شرکت سازنده انجام شد. از نمونه­های برداشته شده از بیضه چپ برای مطالعه با میکروسکوپ الکترونی استفاده شد و نمونه­ها پس از قرار­گیری در محلول گلوتارآلدئید 5/2 % به مدت 12 ساعت با بافر فسفات شستشو داده شده و سپس با تترااکسید اسمیوم 2% برای 2 ساعت پایدار شدند. نمونه­ها بعد از آبگیری، شفاف­ و آغشته­سازی در رزین قالب­گیری شده و با اولترامیکروتوم از آنها نمونه­های نیمه­نازک تهیه و با تولوئیدین بلو رنگ­آمیزی شدند. نمونه­های نازک (nm 80) پس از رنگ­آمیزی با اورانیل استات و سیترات سرب با میکروسکوپ الکترونی انتقالی (LEO-906) مورد مطالعه قرار گرفتند. مطالعه فراساختاری به­طور عمده بر غشاء پایه و سلول­های میوئید متمرکز بود چرا که، این دو ساختمان نقش مهمی در روند اسپرماتوژنز طبیعی دارد.

یافته­ها

     هیستولوژی: در مشاهدات میکروسکوپی  بیضه گروه شاهد، لوله­های سمینی­فر دارای اپیتلیوم ژرمینال ضخیمی بودند و در بافت همبند بین  لوله­های سمینی­فر سلول­های لایدیک قرار داشتند (نگاره 1). مطالعه مورفومتریک نیز نشان داد که میانگین قطر لوله­های سمینی­فر در این گروه 48/7±79/97 میکرومتر می­باشد. در گروه آزمایش 1 که تنها سیسپلاتین دریافت کرده بودند، میانگین قطر لوله­های سمینی­فر به 22/10±91/74  میکرومتر کاهش یافته بود که در مقایسه با گروه شاهد این کاهش معنی­دار بود (05/0p<) (جدول1). در ضمن در این گروه هسته سلول­های اسپرماتوژنیک باقی­مانده در لوله­های سمینی­فر متراکم­تر از گروه شاهد بودند (نگاره 2). مطالعه هیستولوژی لوله­های سمینی­فر در موش­های گروه آزمایش 2 که به همراه سیسپلاتین، سترورلیکس نیز دریافت کرده بودند، نشان داد که خصوصیات لوله­های سمینی­فر تا حدودی مشابه گروه شاهد بود (نگاره 3) و میانگین قطر لوله­های سمینی­فر نیز در این گروه 33/5±61/87 میکرومتر بود که نسبت به گروه شاهد کاهش معنی­د­اری نشان نداد (جدول 1).

هیستوشیمی: مطالعات هیستوشیمی نشان داد که در گروه دریافت­کننده سیسپلاتین تعداد بیشتری از سلول­ها دچار آپوپتوز شده بودند (نگاره 4). بر این اساس میانگین تعداد سلول­های آپوپتوتیک در هر مقطع در گروه شاهد 20/0±27/1، در گروه آزمایش یک 90/0±21/7  و در گروه آزمایش دو  32/0±37/2  بود. مقایسه آماری داده­های به­دست آمده نشان داد که تعداد سلول­های آپوپتوتیک در گروه آزمایش 1 نسبت به گروه شاهد به­طور معنی­داری افزایش یافته است (05/0p<) ولی اختلاف بین گروه­های آزمایش2 و شاهد معنی­دار نبود  (جدول 1).

 

 

نگاره 1- نمای ریزبینی از لوله­های سمینی­فر موش گروه شاهد (رنگ آمیزی PAS، درشت­نمایی 65×).

 

نگاره 2- نمای ریزبینی از لوله های سمینی­فر موشی از گروه آزمایش 1 که سیسپلاتین دریافت کرده است. به کاهش اپیتلیوم ژرمینال و هیپرکروم بودن هسته سلول­ها توجه شود (رنگ آمیزی PAS، درشت­نمایی 65×).

 

نگاره 3- نمای ریزبینی از لوله­های سمینی­فر موشی از گروه آزمایش 2 که به همراه  سیسپلاتین، سترورلیکس نیز دریافت کرده است (رنگ آمیزی PAS، درشت­نمایی 65×).

 

نگاره 4- نمای ریزبینی از لوله­های سمینی­فر موشی از گروه آزمایش 2 که سیسپلاتین دریافت کرده است. به سلول­های آپوپتوتیک دقت شود (رنگ آمیزی Tunnel، درشت­نمایی 260×).

 

جدول 1- مقایسه میانگین تعداد سلول­های آپوپتوتیک و قطر لوله­های سمینی­فر در گروهای مورد مطالعه (میانگین± انحراف معیار)

گروه­ها

تعداد سلول­های آپوپتوتیک

قطر لوله­های سمینی­فر (میکرومتر)

شاهد

20/0±27/1

48/7±79/97

سیسپلاتین

*90/0±21/7

*22/10±91/74

سیسپلاتین+ سترورلیکس

32/0±37/2

33/5±61/87

*: اختلاف معنی­دار با گروه شاهد (05/0p<)

 

میکروسکوپ الکترونی: مطالعات فراساختاری در گروه شاهد نشان داد که بازال لامینا در این گروه کاملاً منظم و شامل 2 لایه تیره و روشن می­باشد که روی آن سلول­های اسپرماتوژنیک و یا سرتولی قرار داشتند. در خارج از بازال لامینا و در مقابل
سلول­های اسپرماتوگونی نیز سلول­های میوئید قرار گرفته بودند (نگاره 5). مطالعه لوله­های سمینی­فر در گروه آزمایش 1 که سیسپلاتین دریافت کرده بودند، نشان داد که غشاء پایه در این گروه نامنظم، موجی شکل و ضخیم­تر شده و همچنین سلول­های میوئید در بافت دور لوله­ای ضخیم­تر و منقبض بودند (نگاره­های 6 و 7). مطالعه لوله­های سمینی­فر در موش­های گروه آزمایش 2 که به همراه سیسپلاتین، سترورلیکس نیز دریافت کرده بودند، نشان داد که اختصاصات لوله­های سمینی­فر تا حدودی مشابه گروه شاهد بود (نگاره 8).

 

نگاره 5- الکترون میکروگرافی از لوله سمینی­فر موشی از گروه شاهد. سلول اسپرماتوگونی (SP)، سلول سرتولی (Ser) و بازال لامینا (Bl) (رنگ آمیزی اورانیل استات و سیترات سرب، درشت­نمایی 4646×).

 

نگاره 6- الکترون میکروگرافی از لوله­های سمینی­فر موشی از گروه آزمایش 1 که سیسپلاتین دریافت کرده است. به سلول میوئید در حال انقباض (M) توجه شود (رنگ آمیزی اورانیل استات و سیترات سرب، درشت­نمایی 4646×).

 

نگاره 7- الکترون میکروگرافی از لوله­های سمینی­فر موشی از گروه آزمایش 1 که سیسپلاتین دریافت کرده است. به غشاء پایه موجی شکل و نامنظم (Bl) توجه شود  (رنگ آمیزی اورانیل استات و سیترات سرب، درشت­نمایی 4646×).

 

نگاره 8- الکترون میکروگرافی از لوله سمینی­فر موشی از گروه شاهد. سلول اسپرماتوگونی (SP)، سلول میوئید (M) (رنگ­آمیزی اورانیل استات و سیترات سرب، درشت­نمایی 4646×).

 

بحث و نتیجه­گیری

    هدف از این مطالعه بررسی توانایی سترورلیکس به عنوان آنتاگونیست GnRH در مهار اثرات سوء سیسپلاتین در لوله­های  سمینی­فر بود. مطالعه ما نشان­دهنده افزایش تعداد سلول­های آپوپتوتیک در گروه دریافت­کننده سیسپلاتین بود که با یافته­های سایر محققین که بیانگر افزایش تعداد سلول­های آپوپتوتیک به­دنبال استفاده از عوامل شیمی­درمانی بود هم­خوانی داشت (Helm and States, 2009; Bakalska et al., 2004; Habermehl et al., 2006; Hou et al., 2005). Print در سال  2000 و Fraccavilla در سال 2002 گزارش کردند، آپوپتوز به صورت محدود در اسپرماتوژنز طبیعی دیده می­شود (Print and Loveland, 2000; Francavilla et al., 2002). نقش آپوپتوز در اسپرماتوژنز نرمال، حذف اسپرماتوگونی­های ناقص و جلوگیری از تولید اسپرم­های معیوب و انتقال نقایص ژنتیکی به نسل آینده (Francavilla et al., 2002; Brinkworth and Nieschlag, 2000) و یا ایجاد تعادل در بین تعداد سلول­های ژرمینال و سرتولی می­باشد (Print and Loveland, 2000). در مورد اثرات سوء سیسپلاتین بر روند اسپرماتوژنز از طریق القاء آپوپتوز نیز مطالعاتی انجام گرفته است که تائید کننده یافته­های مطالعه حاضر می­باشد. به عنوان مثال Giri  و همکاران در سال (1998) نشان دادند که تجویز سیسپلاتین تولید گونه­های فعال اکسیژن (ROS) داخل سلولی را تقویت می­کند و تولید بیش از حد ROS، فراگمانتاسیون DNA را تحریک می­کند و اثرات مخربی بر میتوکندری و غشاء سیتوپلاسمی اسپرم دارد. علاوه براین، اسپرم­ها به­دلیل داشتن غلظت بالایی از اسیدهای چرب اشباع و سیستم آنتی­اکسیدانی ضعیف در معرض صدمات اکسیداتیو می­باشند (Giri et al., 1998). Bieber و همکاران در سال 2006 نشان دادند که در موش­های تیمار شده با سیسپلاتین و اتوپوسید (Etoposid) به مدت 9 هفته آپوپتوز سلول­های زایا حداقل 3 برابر افزایش می­یابد (Bieber et al., 2006) که تائید کننده یافته­های مطالعه حاضر می­باشد.

از طرف دیگر در مورد نحوه آسیب رساندن داروهای مورد استفاده در شیمی­درمانی از جمله سیسپلاتین علاوه بر ایجاد آپوپتوز نظرات دیگری وجود دارد چرا که، مشخص شده است به دنبال شیمی درمانی سطح LH و FSH و در نهایت تستوسترون افزایش پیدا می­کند (da Cunha et al., 1987; Udaqawa et al., 2001; Shetty and Meistrich, 2005; Meistrich et al., 1999) و مشخص شده است که افزایش تستوسترون در داخل بیضه بعد از کابرد مواد سمی، اثر منفی بر اسپرماتوژنز دارد (Shetty et al., 2000) چرا که، افزایش تستوسترون داخل بیضه­ای موجب کاهش بیان membrane bound stem cell factor می­شود که این فاکتورها برای اسپرماتوژنز ضروری می­باشند (Udaqawa et al., 2001).

 یافته­های ما همچنین بیانگر کاهش قطر لوله­های سمینی­فر و انقباض سلول­های میوئید و ضخیم و نامنظم شدن بازال لامینا در گروه دریافت کننده سیسپلاتین بود. این کاهش قطر لوله­های سمینی­فر می­تواند مربوط به انقباض سلول­های میوئید باشد چرا که، به دنبال شیمی­درمانی در نهایت سطح LH وFSH  افزایش پیدا می­کند (Thohda et al., 2001; Meistrich et al., 1998; Spermon et al., 2006) که باعث افزایش سطح هورمون تستوسترون می­گردد. مشخص شده است که سلول­های میوئید حاوی رسپتورهای آندروژنی و استروژنی در طی زندگی جنینی (Shapiro, 2005) و همچنین بعد از تولد  (Pelletier et al., 2000) می­باشند. این سلول­ها همچنین حاوی فیلامان­های اکتین، میوزین، دسمین و اکتینین می­باشند (Maekawa et al., 1996). به عبارت دیگر این سلول­ها شبیه سلول­های عضلانی صاف هستند (Virtanen et al., 1986). با توجه به این که رسپتورهای آندروژنی در سلول­های میوئید قرار دارند، تستوسترون موجب انقباض آنها گردیده است. از طرف دیگر می­توان استدلال کرد که این کاهش قطر می­تواند تا اندازه­ای مربوط به تخلیه لوله­های سمینی­فر از سلول­های اسپرماتوژنیک در اثر بروز آپوپتوز و در نهایت چروکیده شدن آنها باشد.

در این مطالعه غشاء پایه در گروه دریافت کننده سیسپلاتین نامنظم موجی شکل و ضخیم بود. چنین یافته­هایی بعد از اشعه درمانی(Sawada et al., 2003) و لیگاتور مجرای وابران (Richardson et al., 1998) نیز گزارش شده است. نامنظم و موجی شکل بودن غشاء پایه می­تواند مربوط به انقباض سلول­های میوئید و یا مربوط به کاهش قطر لوله­های سمینی­فر باشد. در گروه آزمایش 2 که به همراه سیسپلاتین، سترورلیکس را به­عنوان آنتاگونیست GnRH دریافت می­کردند، بررسی اپیتلیوم اسپرماتوژنیک نشان داد که سترورلیکس تا حدودی اثرات سوء سیسپلاتین را مهار کرده بود و کلاً نتایج کمی و کیفی و هیستوشیمیایی نزدیک به گروه شاهد بود. در تائید این یافته­ها، Udagawa در سال 2001 نشان داد که به­دنبال شیمی­درمانی، درمان با آنالوگ GnRH موجب بهبودی اسپرماتوژنز می­شود (Udaqawa et al., 2001) و یا Meistrich و همکاران در سال 2001 نشان دادند که به­دنبال اشعه­درمانی، آگونیست­ها و آنتاگونیست­های GnRH موجب بهبودی اسپرماتوژنز می­شوند (Meistrich et al., 2001). در مورد مکانیسم آگونیست­ها و آنتاگونیست­های GnRH در حفاظت از اسپرماتوژنز به­طور ساده می­توان گفت که مواد مورد استفاده در شیمی­درمانی و از جمله سیسپلاتین علاوه بر آنکه مستقیماً روی سلول­های در حال تقسیم (به­ویژه اسپرماتوگونی­ها) اثر داشته و موجب القاء آپوپتوز و مرگ آنها می­شوند، بلکه این مواد قسمتی از اثرات خود را از طریق تغییر در هورمون­ها اعمال می­کنند. می­دانیم که بعد از شیمی­درمانی و به دنبال تخریب اسپرماتوژنز مقدار ترشح هورمون­های FSH، LH و در نهایت تستوسترون افزایش پیدا می­کند (da Cunha et al., 1987; Udaqawa et al., 2001; Shetty and Meistrich, 2005; Meistrich et al., 1999; Meistrich and Kangasniemi, 1997). مشخص شده است که افزایش تستوسترون در داخل بیضه بعد از کاربرد مواد سمی، اثر منفی بر روند اسپرماتوژنز دارد (Udaqawa et al., 2001; Shetty et al., 2000; Meistrich et al., 1995 ). بنابراین، به نظر می­رسد با کاهش تستوسترون و  FSH می­توان اسپرماتوژنز را از اثرات سوء داروهای مورد استفاده در شیمی­درمانی محافظت کرد (Bibin et al., 2004; Udaqawa et al., 2001). این دقیقاً همان عملی است که آگونیست­ها و آنتاگونیست­های GnRH انجام می­دهند یعنی، این داروها علاوه براین­که مستقیماً موجب مهار تقسیم در سلول­های اسپرماتوژنز می­شوند و از این طریق این سلول­ها را از اثرات سوء سیسپلاتین حفظ می­کنند، با کاهش    FSHو تستوسترون به طور غیرمستقیم این سلول­ها را از اثرات سوء این هورمون­ها نیز حفاظت می­کنند.

در تائید این نظریه، Shetty و همکاران در سال 2002 نشان دادند که تستوسترون موجب مهار بهبودی اسپرماتوژنز بعد از اشعه­درمانی می­شود (Shetty et al., 2002). همچنین، Meistrich و همکاران در سال 2003 نشان دادند که بعد از مصرف مواد سمی با کاهش تستوسترون می­توان موجب بهبودی اسپرماتوژنز شد (Meistrich and Shetty, 2003). علاوه برتستوسترون، مشخص شده است که در موش­های صحرایی اشعه دیده، در واقع افزایش FSH موجب مهار تمایز اسپرماتوگونی­ها می­شود (Shetty et al., 2002). در مطالعه دیگری مشخص شده است که با سرکوب گنادوتروپین­ها و همچنین تستوسترون می­توان موجب بهبودی اسپرماتوژنز آسیب دیده شد (Shetty et al., 2000).

در کل، نتایج بررسی حاضر نشان داد که استفاده ازسترورلیکس همراه با تجویز سیسپلاتین می­تواند سلول­های اسپرماتوژنیک لوله­های سمینی­فر را از اثرات مخرب سیسپلاتین محافظت کند. 

  • Aminsharifi, A., Shakeri, S., Ariafar, A., Moeinjahromi, B., Kumar, P.V. and Karbalaeedoost, S. (2010). Preventive role of exogenous testosterone on cisplatin-induced gonadal toxicity an experimental placebo-controlled prospective trial. Fertility and Sterility, 93:1388-1393.
  • Andreson, Ph.O., Knoben, J.E. and Troutman, W.G. (2002). Handbook of Clinical Data, 10th Edition, Mc Grow Hill, New York, pp. 136-140.
  • Bakalska, M., Atanassova, N., Koeva, Y., Nikolov, B. and Davidoff, M. (2004). Induction of male germ cell apoptosis by testosterone withdrawal after ethane dimethanesulfonate treatment in adult rats. Endocrine Regulations, 38:103-110.
  • Bar-Shira Maymon, B., Yogev, L., Marks, A., Hauser, R. and Botchan, A. (2004). Sertoli cell inactivation damage to the human testis after cancer chemotherapy. Fertility and Sterility, 81:1391-1394.
  • Behre, H.M., Nashan, D., Hubert, W. and Nieschlag, E. (1992). Depot Gonadotropin releasing hormone against blunts the androgen induced suppression of spermatogenesis in a clinical trial of male contraception. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 74:84-90.
  • Bibin Bibin, A., Tatwei, T., Ishii, M., Mohammad, A. and Yoshiakira K.  (2004). An ultra structural study on cytotoxic effect of mono (2-ethlyhexyl) phthalate (MEHP) on testes in Shiba goat in vitro. Journal of Veterinary Science, 5:235-240.
  • Bieber A.M., Marcon L., Hales B.F., Robaire B. (2006). Effects of chemoth apeutic agents for testicular cancer on the male rat reproduct system, spermatozoa, and fertility. Journal of  Andrology,  27: 189–200.
  • Brinkworth, M.H. and Nieschlag E. (2000). Association of cyclophosphamide induced male mediated, foetal abnormalities with reduced paternal germ cell apoptosis. Mutation Research, 447:149-154.
  • Cook, T. and Sheridan W.P. (2000). Development of GnRH antagonists or prostate cancer: new approaches to treatment. Oncologist, 5:162-168.
  • da Cunha, M.F., Meistrich, M.L. and Nader S. (1987). Absence of testicular protection by a gonadotropin-    releasing hormone analog against cyclophosphamide-induced testicular cytotoxicity in the mouse. Cancer Research, 47:1093-1097.
  • Francavilla, S., D'Abrizio, P., Cordeschi, G., Pelliccione, F., Necozione, S., Ulisse, S., Properzi, G. and Francavilla, F. (2002). Fas Expression correlates with human germ cell degeneration in meiotic and post-meiotic arrest of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction, 8:213-220.
  • Glode, L.M., Robinson, J. and Gould, S.F. (1981). Protection from cyclophosphamide inuced testicular damage with an analogue of gonadotropin releasing hormone. The Lancet, 23:1132-1134.
  • Giri, A., Khynriam, D. and Prasad, S.B. (1998).Vitamin C mediated protection on cisplatin induced mutagenicity in mice. Mutation Research, 421:139-48.
  • Grundker, C., Schlotawa, L., Viereck, V., Eick, N., Horst, A. and Kairies, B.  (2004). Anti proliferative effects of the GnRH antagonist cetrorelix and of GnRH ІІ on human endometrial and ovarian cancer cells are not mediated through the GnRH type І receptor. European Journal of Endocrinology, 151:141-149.
  • Habermehl, D., Kammerer, B., Handrick, R., Eldh, Th., Gruber, Ch., Cordes, N., Daniel, P.T., Plasswilm, L., Bamberg, M., Belka, C. and Jendrossek, V. (2006). Proapoptotic activity of ukrain is mitochondrial death pathway. BioMed Central Cancer, 6:14-41.
  • Helm, C.W. and States, J.C. (2009). Enhancing the efficacy of cisplatin in ovarian cancer treatment could Arsenic have a role. Journal Ovarian Research, 2:2.
  • Hou, M., Chrysis, D., Nurmio, M., Parvinen, M., Eksborg, S., Söder, O. and Jahnukainen, K. (2005). Doxorubicin induces apoptosis in germ line stem cells in the immature rat testis and amifostin cannot protect against this cytotoxicity. Cancer Research, 65:9999-10005.
  • Howell, S.J. and Shalet, S.M. (2005). Spermatogenesis after cancer treatment: Damage and Recovery. Journal of the National Cancer  Institute  Monographs, 34:12-17
  • Kasper, D.L., Braunwald, E., Fauci, A.S., Hauser, S.L., Longo, D.L. and Jameson, J.L. (2005). Harrisons Principles of Internal Medicine. 16th ed. McGraw Hill, Medical Publishing Division, New York, pp. 114-118.
  • Kazumasa, N., Yutaka, N., Masaaki, K., Shunichi, N., Takahiko, S., Akira, Y., Masahiro, F., Kiyoshi M.,  Koshiro W., Tomohide T., Seiichiro Y. and Nagahiro S. (2002). Irinotecan plus cisplatin compared with etoposide plus cisplatin for extensive small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine, 346:85-91.
  • Köberle, B., Tomicic, M., Usanova, S. and Kaina, B.  (2010). Cisplatin resistance: preclinical findings and clinical implications. Biochemica et Biophysica Acta, 1806:172-182.
  • Maekawa, M., Kamimura, K. and Nagano, T.  (1996). Peritubular myoid cells in the testis: their structure and function. Archives of Histology and cytology, 59:1-13.
  • Meistrich, M.L. (1998). Hormonal stimulation of the recovery of spermatogenesis following chemo-or radiotherapy. Acta Pathologica Microbiologia et Immunologia Scandinavica, 106:37-46.
  • Meistrich M.L. and Kangasniemi, M. (1997). Hormone treatment after irradiation stimulates recovery of rat spermatogenesis from surviving spermatogonia. Journal of Andrology, 18:80-87.
  • Meistrich, M.L., Parchuri, N., Wilson, G., Kurdogluy, B. and Kangasniemi, M.  (1995). Hormonal protection from cychlophosphamide induced inactivation of rat stem spermatogonia. Journal of Andrology 16:334-341.
  • Meistrich, M.L. and Shetty, G.  (2003). Inhibition of spermatogonial differentiation by testosterone. Journal of Andrology, 24(2):135-148.
  • Meistrich, M.L., Wilson, G. and Huhtaniemi, I. (1999). Hormonal treatment after cytotoxic therapy stimulates recovery of spermatogenesis. Cancer Research, 59:3557-3560.
  • Meistrich, M.L., Wilson, G., Shuttlesworth, G., Huhtaniemi, I. and Reissmann, T.  (2001). GnRH agonists and antagonists stimulate recovery of fertility in irradiated LBNF1 rats. Journal of Andrology, 22:809-817.
  • Nejad, M.D., Rad, S.J., Roshankar, L., Karimpor, M., Ghanbari, A.A., Azami, A. and Valilou, M.R. (2008). Effect of Thiotepa on mice Spermatogenesis using light and electronic microscope. Pakistan Journal of Biology Sciences, 11:1929-1934.
  • Pelletier, G., Labrie, C. and Labrie, F.  (2000). Localization of oestrogen receptor alpha, oestrogen receptor beta and androgen receptors in the rat reproductive organs. Journal of Endocrinology, 165:359-370.
  • Print, C.G. and Loveland, K.L. (2000). Germ Cell Suicide: new insight in to apoptosis during spermatogenesis. BioEssays, 22:423-430.
  • Richardson, L.L., Kleinman, H.K. and Dym, M. (1998). Altered basement membrane synthesis in the testis after tissue injury. Journal of Andrology, 19:145-155.
  • Roberts, R.  (200). Apoptosis in toxicology. Taylor and Francies, London, pp. 130-204.
  • Sawada, H. and Esaki, M. (2003). Electron microscopic observation of 137Cs-irradiated rat testis: production of basal laminae for germ cells, despite their absence. Journal of Electron Microscopy (Tokyo), 52:391-397.
  • Sawhney, P., Giammona, C.J., Meistrich, M.L. and Richburg, J.H. (2005). Cisplatin-induced long-term failure of spermatogenesis in adult C57/Bl/6J mice. Jouanal of Andrology, 26:136-145.
  • Seaman, F., Sawhney, P., Giammona, C.J. and Richburg, J.H. (2003). Cisplatin-induced pulse of germ cell apoptosis precedes long-term elevated apoptotic rates in C57/BL/6 mouse testis. Apoptosis, 8:101-108.
  • Shapiro, E., Huang, H., Masch, R.J., Mcfadden, D.E. and Wu, X.R. (2005). Immunolocalization of androgen receptor and estrogen receptors alpha and beta in human fetal testis and epididymis. Journal of Urology, 174:1695-1698.
  • Shetty, G. and Meistrich, M.L.  (2005). Hormonal approaches to preservation and restoration of male fertility after cancer treatment. Journal of the National Cancer Institute Monographs, 34:36-39.
  • Shetty, G., Wilson, G., Hardy, M.P., Niu, E., Huhtaniemi, I. and Meistrich, M.L. (2002). Inhibition of recovery of spermatogenesis in irradiated rats by different androgens. Endocrinology, 143:3385-3396.
  • Shetty, G., Wilson, G., Huhtaniemi, I., Shuttlesworth, G.A., Reissmann, T. and Meistrich, M.L. (2000). Gonadotropin-releasing hormone analogs stimulate and testosterone inhibits the recovery of spermatogenesis in irradiated rats. Endocrinology, 141:1735-1745.
  • Spermon, J.R., Ramos, L., Wetzels,  A.M.M. , Sweep,  C.G.J.,  Braat, D.D.M. , Kiemeney,  L.A.L.M. and Witjes, J.A. (2006). Sperm integrity pre- and post-chemotherapy in men with testicular germ cell cancer. Human Reproduction, 21:1781-1786.
  • Tevor, A.J., Katzung, B.G. and Masters, S.B. (2002). Katzung and Trevoor's Pharmacology. 6th Edition, McGraw Hill, Philadelphia, pp. 206-208.
  • Tohda, A., Matsumiya, K., Tadokoro, Y.,Yomogida, K., Miyagawa, Y., Dohmae, K., Okuyama, A. and Nishimune,  Y. (2001). Testosterone suppresses spermatogenesis in juvenile spermatogonial depletion (jsd) mice. Biology of Reproduction, 65:532-537.
  • Turk, G., Atessahin, A., Sonmes, M., Yuce, A. and Ceribasi, A.O. (2007). Lycopene protects against cyclosporine a induced testicular toxicity in rats. Theriogenology, 67:778 -785.
  • Udagawa, K., Ogawa, T., Watanabe, T., Yumura, Y., Takeda, M. and Hosaka, M. (2001). GnRH analog, leuprorelin acetate, promotes regeneration of rat spermatogenesis after severe chemical damage. International Journal of Urology, 8:615-622.
  • Velasquez, W.S., Cabanillas, F., Salvador, P., Mclaughlin, P., Fridrik, M., Tucker, S., Jagannath, S., Hagemeister, F.B., Redman, J.R. and Swan, F.  (1988). Effective salvage therapy for lymphoma with cisplatin in combination with high-dose ara-c and dexamethasone (DHAP), Blood, 71:117-12.             
  • Virtanen, I., Kallojoki, M. and Narvanen, O. (1986). Peritubular myoid cells of human and rat testis are smooth muscle cells that contain desmin-type intermediate filaments. Journal of Anatomy Research, 215:10-20.