بررسی حضور آنتی‌بادی ضد زونا پلوسیدا در سرم خون گاوهای شیری هلشتاین مبتلا به تکرر فحلی

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاداسلامی، واحدتبریز، دانشکده دامپزشکی، استادیار گروه علوم درمانگاهی، تبریز، ایران.

2 دانشگاه آزاداسلامی، واحدتبریز، دانشکده دامپزشکی، دانش‌آموخته دکتری حرفه‌ای دامپزشکی، تبریز، ایران.

چکیده

   این مطالعه به­منظور بررسی وجود آنتی بادی ضد زونا پلوسیدا در سرم گاوهای هلشتاین مبتلا به تکرر فحلی در ایستگاه سوم پرورش گاو شیری شرکت کشت و صنعت و دامپروری مغان صورت گرفت. تحقیق روی 168رأس گاو ماده غیر آبستن با تاریخچه ابتلا به تکرر فحلی (Repeat breeder) انجام گردید. دام‌های‌ انتخاب شده از نظر سنی به دو گروه زیر سه شکم زایمانی و بالای سه شکم زایمانی انتخاب گردیدند. از هریک از دام­ها 10 میلی­لیتر خون از ورید وداج اخذ شد و سرم آنها جدا گردید. وجود آنتی­بادی­های ضد ZP در سرم دام‌ها توسط کیت­های تجاری آزمایش ELISA (بیوسرو دیاگنوستیکا، زونا پلوسیدا آنتی­بادی ELISA، BS-20-20 آلمان) آزمایش گردید. از تعداد کل 168 رأس دام مورد آزمایش 13 رأس دارای آنتی­بادی ضد زونا پلوسیدا (تیتر مثبت) و تعداد 155 رأس فاقد آنتی بادی (تیتر منفی) بودند که به ترتیب 74/7 درصد دارای تیتر مثبت و26/92 درصد بدون تیتر بودند. از لحاظ تقسیم‌بندی سنی، از تعداد کل 168 رأس دام تحت مطالعه،109 رأس زیر سه شکم زایمان بوده و 59 رأس بالای سه شکم زایمان بودند. از تعداد 109 رأس دام زیر سه شکم 5 رأس دارای آنتی‌بادی ضد زونا پلوسیدا (تیتر مثبت) و از تعداد 59 رأس دام بالای سه شکم زایمان، 8 رأس دارای آنتی بادی ضد زونا پلوسیدا (تیتر مثبت) بودند. نتایج نشان داد با احتمال 99% تفاوت بسیار معنی‌داری بین دو گروه زیر شکم 3 و بالای شکم 3 وجود دارد (07/2=Z) و این به معنای آن است که افزایش سن تاثیر معنی‌داری در میزان ظهور آنتی‌بادی ضد زونا پلوسیدا در سرم این دسته از دام‌ها دارد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Evaluation of the presence of anti zona pellucida Antibodies is the serum of repeat breeder Holstein dairy cattle

نویسندگان [English]

  • amirali kaveh 1
  • hossein nikniyaz 2
چکیده [English]

   This study was conducted to evaluate the presence of anti zona pellucida antibodies in the serum of  repeat breeder Holstein cows in Third station Dairy Cattle Husbandry Agro Industry  in Moghan. The study was conducted on 168 non-pregnant cows with a history of Repeat breeder. Animals were selected in two age groups ¸ more than three times calving or less. Ten ml of blood were obtained from Animals from the jugular vein and serum was separated. The presence of anti-ZP antibodies in animal sera were tested by commercial test kits for ELISA (Bioserve Diagnostic, Zona pellucida antibody ELISA, BS-20-20, Germany). From a total of 168 tested animals, 13 animals tested positive (7.74%) and 155 animals were negative (92.26%). Five of 109 cattle with less than three calving were positive and 8 of 59 animals with more than three calving were positive. The results showed highly significant differences between the two groups (Z=2/07) and this means that increasing age has a significant effect on the rate of appearance of anti zona pellucida antibodies in the serum of these animals.

کلیدواژه‌ها [English]

  • antibodies
  • Zona pellucida
  • repeat breeder
  • Holstein

مقدمه

   در صنعت دامپروری امروز میزان باروری و زاد و ولد دام­ها بسیار حائز اهمیت است چراکه کاهش باروری  هم در پرورش گاو‌های‌ شیری و هم در پرورش گوساله‌های‌ گوشتی باعث زیان­های اقتصادی فراوانی می‌شود و به­طورکلی می‌توان گفت که میزان باروری از ارکان اصلی این صنعت می‌باشد.

   امروزه برای شناخت دلایل ناباروری یا کم‌باروری مطالعات زیادی صورت گرفته است که اغلب هم به نتایج چشمگیری منتهی گردیده است. یکی از دلایل ناباروری اختلال در اتصال اسپرم‌ها به تخمک می‌باشد. لایه شفاف دور تخمک پستانداران یا زونا پلوسیدا (ZP) در این اتصال نقش مهمی دارد (Barber and Lee 2001).

   زونا پلوسیدا ماتریکس خارج­سلولی است که اووسیت پستانداران را احاطه می­نماید. در اغلب گونه‌های پستانداران این ماتریکس شامل سه گروه گلیکوپروتئینی است که احتمالاً تغییرات ثانویه‌ای را جهت کسب خصوصیات ایمونولوژیکی و بیوشیمیایی   متفاوت، تحمل می­کنند (Wassarman, 1999). زونا پلوسیدا در تشخیص و اتصال اسپرم به اووسیت دخالت دارد و به سبب نقش عمده آن در روند باروری (واکنش با اسپرم، القای واکنش آکروزوم، کنترل جمعیت اسپرم‌ها)، به عنوان یک آنتی­ژن برای القای پاسخ ایمنولوژیکی برای باروری جنس ماده استفاده شده است. زونا پلوسیدا  دیواره­ای کروی حول اووسیت تشکیل می­دهد که دارای ضخامت یکسان در هر گونه   می­باشد (دسته­بندی  در پستانداران). Barber, 2001) Wassarman, 1999;) این دیواره از 3 پروتئین اصلی تشکیل شده است که در بسیاری از گونه­ها مورد مطالعه قرار می­گیرند: ZP1، ZP2 و ZP3.

   ایمن کردن ماده­ها با گلیکوپروتئین­های ZP منجر به مهار باروری در بسیاری از مدل­های حیوانی می­گردد. مطالعات روی ایمنی­زایی فعال با آنتی­بادی­های ضد ZP آشکار کرده است که در بیشتر گونه­های حیوانی ایمن شده، ناباروری موقتی می­تواند در طول افزایش تیترهای آنتی­بادی رخ دهد که همیشه با نارسایی تخمدان و تغییرات تخریبی در فولیکول­های تخمدانی مرتبط می‌باشد. وقتی آنتی­ژن­های بومی از گونه­های متفاوت و ناهمسان برای ایمنی­زایی استفاده شوند، حیوانات ایمن اغلب ایجاد آنتی­بادی­های ضد ZP خودواکنشی می­کنند و این وضعیت منجر به ناباروری می­گردد (Briggs et al., 1999; Garza et al., 1998; Hinsch et al., 1998; Kolle et al., 1998; Skinner et al., 2004; Topper et al., 2007).

   واضح است که ZP های اخذ شده از گونه­های بسیاری از پستانداران به­صورت نزدیکی شبیه به هم می­باشند (90-40%). این ZP ها از یک تعداد حیوانات جدا شده و شناسایی گردیدند و شباهت قابل توجهی در گونه­های حیوانی در مطالعات گذشته وجود دارد. برای مثال، شباهت بین پروتئین­های ZP گاوی و خوکی به 83% می‌رسید (Wassarman, 1999).

   کاهش باروری اصولاً به تداخل آنتی­بادی با پیوند اسپرم ـ تخمک نسبت داده می­شود که موجب عدم لقاح می­گردد. با این حال، برخی از اختلالات تخمدانی، کاهش در وزن تخمدان و رشد فولیکولی و تفاوت فولیکولی غیرطبیعی نیز گزارش شده­اند. همچنین مدارکی از آنتی­بادی­های ضدZP پلی­کلونال که ممکن است از نفوذ اسپرم به ZP ممانعت به عمل بیاورد ولی اثری روی اتصال اسپرم به ZP نداشته باشد، وجود دارد (Mahi-Brown, 2008; Hasegawa, 2002; Barber and Fayrer-Hasken, 2000).

 

مواد و روش‌ها

   این مطالعه در ایستگاه سوم پرورش گاو شیری شرکت کشت و صنعت و دامپروری مغان صورت گرفت. تعداد 200 رأس گاو ماده غیر آبستن هلشتاین به­طور تصادفی و با تاریخچه ابتلا به تکرر فحلی (Repeat breeder) انتخاب گردیدند. ملاک ابتلا به تکرر فحلی تعداد تلقیح بیش از سه بار در دوره بعد از آخرین زایمان در نظر گرفته شد. ماده گاوهای انتخاب شده از نظر سنی از دو رده زیر سه شکم زایمانی و بالای سه شکم زایمانی انتخاب گردیدند. وضعیت تولید مثلی گاوها توسط روش اولتراسونوگرافی و راست روده‌ای مورد بررسی قرار گرفت. دام‌های تحت مطالعه از نظر سایر بیماری‌ها مانند ورم پستان، لنگش، پنومونی، اختلالات دستگاه گوارش معاینه گشته و تعداد 168 رأس از دام‌های سالم انتخاب شدند. تمامی دام‌ها از نظر بیماری‌هایی مثل تب‌برفکی، سل و بروسلوز  واکسینه شده بودند.

تاریخچه دام‌ها از نظر بروز سخت‌زایی و جفت‌ماندگی و سایر عفونت‌های رحمی مثل آندومتریت و متریت از قسمت ثبت مشخصات مجتمع جمع‌آوری گردید. از هریک از دام‌ها 10 میلی­لیتر خون از ورید وداج گرفته شد و پس از انتقال نمونه‌ها در یخچال به آزمایشگاه، نمونه‌های‌ خونی به­مدت 10 دقیقه با سرعت 3000 دور در ثانیه سانتریفیوژ شده و سرم آنها جدا گردید. نمونه‌های‌ سرمی به­دست آمده تا زمان آزمایشات در دمای نگه­داری شد. وجود آنتی­بادی­های ضد ZP در سرم دام‌ها توسط کیت­ تجاری آزمایش ELISA (بیوسرو دیاگنوستیکا، زونا پلوسیدا آنتی­بادی ELISA، BS-20-20 آلمان) آزمایش گردید. جهت آنالیز آماری داده‌ها از نرم‌افزار آماری SPSS استفاده شد. فرضیه اول به­صورت توصیفی بیان شد و برای فرضیه دوم از روش آماری آزمون نسبت‌ها استفاده گردید.

 

یافته‌ها

از تعداد کل 168 رأس دام مورد آزمایش 13 رأس دارای آنتی‌بادی ضد زونا پلوسیدا (تیتر مثبت) و تعداد 155 رأس فاقد آنتی‌بادی (تیتر منفی) بودند که به ترتیب 74/7% دارای تیتر مثبت و26/92% بدون تیتر بودند.

 

 

نمودار 1- نمودار دام­های تیتر مثبت و منفی آنتی‌بادی ضد زونا پلوسیدا

 

 

 

نمودار 2- نمودار دام­های تحت آزمایش از نظر تعداد شکم زایمان

از لحاظ تقسیم‌بندی سنی، از تعداد کل 168 رأس دام تحت مطالعه، 109 رأس زیر سه شکم زایمان بوده و 59 رأس بالای سه شکم زایمان بودند.

 

 

 

از تعداد 109 رأس دام زیر سه شکم 5 رأس دارای آنتی‌بادی ضد زونا پلوسیدا (تیتر مثبت) و از تعداد 59 رأس دام بالای سه شکم زایمان، 8 رأس دارای آنتی‌بادی ضد زونا پلوسیدا (تیتر مثبت) بودند.

 

 

 

 

 

نمودار 3- نمودار دام­های تیتر مثبت و منفی در دام­های زیر سه شکم زایمان

 

 

 

 

 

 

نمودار 4- نمودار دام­های تیتر مثبت و منفی در دام­های بالای سه شکم زایمان

 

 

بر اساس آنالیز آماری با روش آزمون نسبت‌ها، با احتمال 99% تفاوت معنی‌داری بین دو گروه زیر سه شکم و بالای سه شکم وجود دارد (07/2=Z) و این به معنای آن است که افزایش سن تاثیر معنی‌داری در میزان ظهور آنتی‌بادی ضد زونا پلوسیدا در سرم این دسته از دام‌‌ها‌ دارد.

 

بحث و نتیجه‌گیری

   با وجود پیشرفت در درک فیزیولوژی تولید مثل در 30 تا 40 درصد از حیوانات نابارور علت ناباروری آنها هنوز ناشناخته مانده است. زونا پلوسیدا خصوصیات ایمنی­زایی قدرتمندی دارد و آنتی­سرم را به­صورت تاثیرگذاری جهت مهار باروری برمی‌انگیزاند. سطح بالای تیترهای آنتی­بادی ضد زونا پلوسیدا اغلب به­خوبی با شیوع ناباروری مرتبط می‌باشند. مطالعات متعددی پیشنهاد کرده‌اند که آنتی‌بادی ضد زونا پلوسیدا (آنتی‌بادی ضد ZP) ممکن است در پاتوژنز ناباروری ایدیوپاتیک در این حیوانات نقش بازی کند Krickpatrick, 2002; Liu, 2005; turner, 2002)). مطالعات روی ایمن‌سازی فعال با آنتی‌بادهای ضد ZP نشان داد که در بیشتر گونه‌های‌ جانوری، نارسایی تخمدان اغلب با تغییرات مخرب در فولیکول‌های تخمدانی ارتباط دارد (Briggs et al.,1999; Hinsch et al., 1998; Skinner et al., 2004; Kolle et al., 2007).

   هنگامی که آنتی‌ژن‌های بومی ZP از گونه‌های‌ متفاوت برای ایمن‌سازی مورد استفاده قرار گرفت حیونات واکسینه غالباً به‌طور خودبه­خود تولید آنتی‌بادی ZP می‌کنند و این وضعیت منجر به ناباروری می‌شوند. روشن است که زونا پلوسیدای طیف گسترده‌ای از پستانداران (40 تا 90 درصد) مشابه هستند که در تعدادی از حیوانات جداسازی و طبقه‌بندی شده  و همسانی قابل توجهی در گونه‌های‌ پستانداران تا کنون گزارش شده است. به عنوان مثال، همسانی پروتئین زونا پلوسیدا در گاو و خوک به 83% می‌رسد (Zhu et al., 1999; Wassarman et al., 1999). کاهش باروری عمدتاً به اختلال در اتصال اسپرم به تخمک نسبت داده می‌شود تا عدم تخمک‌گذاری و سیکل‌های‌ غیرطبیعی با این حال برخی از اختلالات تخمدان مثل کاهش وزن تخمدان و تمایز غیرطبیعی فولیکولی نیز گزارش شده است. همچنین مدارکی وجود دارند که آنتی‌بادی پلی‌کلونال ضد ZP ممکن است از نفوذ اسپرم به ZP جلوگیری کند، اما هیچ تاثیری بر اتصال اسپرم به ZP ندارد(Fayrer et al., 2001; Hosken et al., 2000; Hasegawa et al., 2002; Mahi-Brown et al., 2002)در حال حاضر، پروتئین­های ZP به­خاطر ظرفیت آنتی‌ژنیکی خود به­عنوان جایگزین­هایی اصلی برای تولید واکسن­های ضدباروری در نظر گرفته می­شوند. به­علاوه آنتی­ژن­های ZP برای دستگاه تولید مثلی خاص می­باشند و به جریان خون نمی­رسند. بدین ترتیب، احتمال مشاهده توسعه مجموعه­های ایمنی و تغییرات در سایر بافت­ها وجود ندارد. به هر حال، مشاهده شده است که پاسخ ایمنی القا شده می­تواند متغیر باشد و به ساختار ایمیونوژنیک استفاده شده در گونه­های ایمن بستگی داشته باشد. در اثر اینکه گلیکوپروتئین­های ZP خاصیت آنتی­ژنی ضعیفی دارند، ایمنی­زایی حیوانات با استفاده از زونا پلوسیدای سایر گونه­ها انجام می­شود. بدین ترتیب، آنتی بادی­ها علیه پروتئین­های زونا پلوسیدای خوک واکنش متقاطعی را با گلیکوپروتئین‌های زونا پلوسیدای سایر گونه­های نشان دادند. این حالت باعث گردیده که جداسازی و خالص‌سازی پروتئین­های زونا پلوسیدای خوک و استفاده از آنها به عنوان واکسن در گونه­های پستانداران وحشی و اهلی مختلف امکان پذیر باشد. بدین‌ترتیب، از نظریه­ای که آنتی­بادی­های القا شده به ZP اووسیت‌های حیوانات درمان شده می­چسبند و باروری را توسط جلوگیری از اتصال و نفوذ اسپرماتوزوا مهار می­کنند، حمایت می­نماید.

   برای توضیح اختلالات تخمدان، برخی مطالعات نشان داده­اند که وجود آپی­توپ­های سلول­های T اوفریتوژن در ایمنی­زایی می­تواند منجر به پاسخ التهابی که با توسعه اووسیت­ها که با آنتی­بادی همراه است، شود (Skinner et al., 2004).

   در مطالعه حاضر اندازه‌گیری میزان آنتی‌بادی ضد ZP گاوهای شیری هلشتاین مبتلا به تکرر فحلی، در سنین مختلف بر اساس تعداد زایمان صورت گرفت. سایر دانشمندان نشان دادند بر اساس وضعیت آبستنی نیز، میزان آنتی­بادی­های مثبت ممکن است متفاوت باشد. در مطالعه حاضر، اختلاف معنی­داری در وجود تیتر مثبت و تیتر منفی در بین حیوانات ماده نابارور از لحاظ سنی، وجود دارد. با این حال، برخی از دانشمندان گزارش کردند که آنتی­بادی­های ضد ZP ممکن است در تیترهای مشخصی در حیوانات آبستن نیز یافت شوند (Bradley, 2004; Boyles and Ahmadzadeh, 2005; Harris et al., 2004).

در مطالعات دیگر اختلاف معنی­داری بین گروه­هایی که نتایج آنها بر اساس نژاد انجام شده، وجود داشت (Del los reyes and Barros, 2003; Blril and Wassarman, 2001; Asbuy and leyle, 2003)). در تحقیق دیگری گزارش گردید که بر اساس وضعیت آبستنی نیز، میزان آنتی‌بادی­های مثبت ممکن است متفاوت باشد (Barber and Fayrer-Hosken, 2003). ایشان در نژاد‌های‌ مختلفی مثل براون سویس میزان تیتر مثبت آنتی‌بادی ضد زونا پلوسیدا را 22/1 درصد و در نژاد هلشتاین 13/3 درصد و در نژادهای مختلط 03/3 درصد گزارش نمودند. در همین مطالعه درصد دام‌های نژاد سمینتال دارای تیتر مثبت آنتی‌بادی صفر گزارش گردید. نتایج حاصل از تحقیق حاضر نشان می‌دهد که در نژاد هلشتاین موجود در منطقه شمال غرب ایران، میزان وجود این آنتی­بادی 74/7% است. نتایج حاصل از مطالعه صورت گرفته توسط نگارندگان نشان می‌دهد که در نژاد بومی و دو رگ منطقه کردستان به­طور کلی 17 درصد دام‌های غیرآبستن  نابارور دارای تیتر مثبت این آنتی‌بادی می‌باشند که نتایج حاصل در این مطالعه با تحقیق مذکور چندان مطابقتی ندارد. ولی، سایر محققین گزارش کردند که آنتی­بادی­های ضد ZP ممکن است در تیترهای مشخصی در حیوانات آبستن نیز یافت شوند (Asbuy and Lyle, 2003) .نکته قابل توجه و تأمل در مطالعه حاضر این است که با افزایش سن دام‌ها میزان موارد مثبت تیتر آنتی‌بادی به­طور معنی‌داری افزایش می‌یابد. شاید این امر به این دلیل باشد که با افزایش سن، توانایی و کفایت تولید مثلی کاهش یافته و به­صورت اختلالات تولید مثلی بروز می‌نماید. شاید بتوان گفت که اتفاقات مختلفی نظیر کمبودهای تغذیه‌ای، استرس ناشی از تولید، اختلالات تخمدانی و دستگاه تناسلی که با افزایش سن احتمال وقوع آنها نیز بیشتر می‌شود، می‌توانند نقشی در افزایش میزان این آنتی‌بادی در بدن دام داشته باشند که البته تحقیق در مورد تاثیر هرکدام از این موارد نیازمند مطالعات تکمیلی بیشتری است. احتمالاً فاکتورهای اضافی، نظیر تیتر یا سایر خصوصیات آنتی­بادی­ها در این بین نیز نقش داشته و از این طریق می‌توانند دارای اثرات سوئی بر باروری باشند. نقش دقیقی که این آنتی­بادی­ها در ارتباط با باروری بازی می‌کنند، نیازمند مطالعات بیشتر می­باشد.

  • Asbuy, A.C. and Lyle, S.K. (2003). Infectious causes of infertility In Equine Reproduction. In: Equine reproduction.A.O., McKinnon, J.L. editors. 6th ed., Philadelphia, pp: 381-391.
  • Barber, M., Lee, S., Steffens, W., Ard, M. and Fayrer- Hosken, R. (2001). Immunolocalization of zona pellucid antigen in the ovarian follicle of dogs, cats, horses and elephants. Theriogenology, 55: 1705-1717.
  • Barber, M.R. and Fayrer-Hosken, R.A. (2000).Possible mechanisms of mammalian immunocontraception. Journal of Reproductive Immunology,46: 103-124.
  • Bleil, J. and Wassarman, P. (2001). Mammalian sperm-egg interaction: identification of a glycoprotein in mouse egg zona pellucidae possessing receptor activity for sperm cell, Nature Cell Biology, 20: 287-882.
  • Byles, S. and Ahmadzadeh, A. (2005). Immuno contraception to help control feral cat populations. In:Consultation in Feline Internal Medicin.Philadelphia: Saunders, pp: 577-582.
  • Bradley, M. (2004). Experimental strategies for the development of an immunocontraceptive vaccine for European red fox, Journal of Reproduction and. Fertility., 6: 307-317.
  • Briggs, D., Mille, D. and Gosden, R., (1999). Molecular biology of female Gametogenesis. In: Molecular Biology in Reproductive Medicine. New York: Parthenon Publishing,  pp: 251-270.
  • Del losReyes, M. and Barros, C. (2000). Immunolocalization of procin/Acrosin in bovines and bovine sperm penetration throught the zona pellucida. Animal  Reproduction. Scinces, 58: 215-228.
  • Fayrer-Hosken, R., Dookwah, H., Brandon, C. (2000). Immunocontrol in dogs Animal  Reproduction. Scinces, 60-61: 365-373.
  • Garza, K.M., Lou, Y.H. and Tung, K.S. (1998). Mechanism of ovarian autoimmunity,Journal  of Reproductive Immunology., 39(2): 391-413.
  • Harris, J., Hibler, D., Fontenot, G., Hsu, K., Yuresvjch, E. and Sacco, A. (2004). Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a variety of mammalian species: The ZPA, ZPB and ZPC gene familiesDNA Sequence, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY., 4: 361-393.
  • Hasegawa, A., Koyama, K., Inoue, M., Takemura, T. and Isojima, S. (2002). Antifertility effect of active immunization with zp4 glycoprotein family of porcine zona pellucida in hamsters. Journal of Reproduction and Fertility,22: 97-210.
  • Hinsch, E., Hagele, W., Bohie, R.M., Schill, W.B. and Hinsch, K.D. (1998). Evaluation of zp2domains of functional importance with antisera against synthetic zp2 peptides. Journal of Reproduction and Fertility,114: 245-251.
  • Kolle, S., Sinowatz, F., Boie, G. and Palma, G. (1998). Differential expression of zpc in the bovineovary, oocyte and embryo.Molecular Reproduction and Development,49: 435-443.
  • Kirkpatrick, J.F., Liu, I.M., Turner, J.W., Naugle, R. and Keiper, R. (2002).Long-term effects ofporcine zona pellucidae immunocontraception on ovarian function in feral horses (Equus caballus). Journal of Reproduction and Fertility, 94: 437-444.
  • Liu, I.K., Turner, J.W., Van Leeuwen, E.M., Flanagan, D.R., Hedrick, J.L., Mmrata, K., et al. (2005).Persistence of anti-zonae pellucidae antibodies following a singleinoculation of porcine zonae pellucidae in the domestic equine. Reproduction, 129: 181-190.
  • Mahi-Brown, C.A., Huang, T.T. and Yanagimachi, R. (2002). Infertility in bitches induced by active immunization with porcine zonae pellucidae.Journal of Experimental Zoology, 20: 89- 95.
  • Mahi-Brown, C.A., Yanagmachi, R., Hoffman, J.C. and Huang, T.T. (2005).Fertility control in the bitch by active immunization with porcine zonae pellucidae: Use of different adjuvant and patterns of estradiol and progesterone levels in estrous cycles. Biology of Reproduction, 32: 761-772.
  • Mahi-Brown, C.A., Yanagimachi, R., Nelson, M.L., Yanagimachi, H. and Palumbo, N. (2008). Ovarian histopathology of bitches immunized with porcine zonae pellucidae. American Journal of Reproductive Immunology and Microbiology,18: 94-103.
  • Skinner, S.M., Mills, T., Kirchick, H.J. and Dunbar, B.S. (2004).Immunization with zona pellucida proteins results in abnormal ovarian follicular differentiation and inhibition of gonadotropininduced steroid secretion. Endocrinology, 115: 2418-2432.
  • Topper, E.K., Kruijt, L., Calvete, J., Mann, K., Topfer-Peteren, E. and Woelders H. (2007). Identification of bovine zona pellucid glycoprotein’s. Molecular Reproduction and Development, 46: 344-350.
  • Turner, J.W., Liu, I.K., Flanagan, D.R., Bynum, K.S. and Rrtberg, A.T. (2002).Porcine zona pellucida(PZP) immunocontraception of wild horses (Equus caballus) in Nevada: a 10 year study. Reproduction, 60: 177-186.
  • Wassarman, P., Chen, J., Cohen, N., Litscher, E., Liu, C. and Williams, Z. (1999). Structure andfunction of the mammalian egg zona pellucida. Journal of Experimental Zoology, 15: 251-258.
  • Zhu, X. and Naz, RK. (1999).Comparison of zp3 protein sequences among vertebrate species: to obtain a consensus sequence for immunocontraception. Frontiers of Bioscience, 4: 212-215.