عه اثرات محافظتی رزوراترول (Resveratrol) بر سمیّت کبدی داروی شیمی‌درمانی سیسپلاتین در موش صحرایی

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسنده

دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، استادیار گروه آموزشی علوم درمانگاهی، تبریز، ایران.

چکیده

   دارو درمانی سرطان که با استفاده از مواد طبیعی، صناعی یا بیولوژیک انجام می­شود، با عوارضی همراه است. سیسپلاتین به­عنوان یک داروی ضدسرطان، در دوزهای بالا برای کبد سمّی است. معلوم شده که استرس اکسیداتیو در سمّیت سیسپلاتین دخیل است. با توجه به اثرات آنتی­اکسیدانی رزوراترول، این مطالعه، برای ارزیابی اثرات محافظتی آن در برابر سمیّت کبدی سیسپلاتین در موش­صحرایی انجام شد. 40 سر موش صحرایی نر ویستار به­طور تصادفی در چهار گروه مساوی تقسیم گردید. گروه 1 به­عنوان شاهد انتخاب شد. برای ایجاد آسیب کبدی، سیسپلاتین (mg/kg 3)  هر 5 روز یکبار به‌صورت داخل صفاقی به گروه‌های 2 تا 4 تزریق شد. گروه 3 سیلیمارین (mg/kg 100) و گروه‌ 4 رزوراترول (mg/kg 20) را با تزریق داخل صفاقی روزانه به‌مدت 4 هفته دریافت کردند. در پایان، سطوح سرمی آنزیم‌های آسپارتات و آلانین آمینوترانسفراز و لاکتات دهیدروژناز و بیلی‌روبین تام، آلبومین و پروتئین تام اندازه­گیری شد. میزان مالون­دی­آلدئید، گلوتاتیون احیاء و فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز نیز در هموژنات بافت کبد اندازه­­گیری شد. در نهایت، یافته­های بیوشیمیایی با نتایج هیستوپاتولوژی مطابقت داده شد. در گروه 4،  رزوراترول به‌طور معنی‌داری (001/0p<) میزان افزایش یافته آنزیم‌های شاخص آسیب کبد و بیلی‌روبین تام را کاهش و سطوح کاهش یافته آلبومین و پروتئین تام سرم را به‌طور معنی‌داری (001/0p<) افزایش داد. رزوراترول در این گروه، به طور معنی‌داری (001/0p<) میزان پراکسیداسیون لیپیدی را کاهش و سطوح آنتی­اکسیدان­های کبد را افزایش داد. از لحاظ آسیب­شناسی بافتی نیز تغییرات با یافته­های بیوشیمیایی همراستا بودند.  نتایج بررسی حاضر نشان داد که رزوراترول با خواص آنتی‌اکسیدانی خود، کبد موش­های صحرایی را در برابر سمّیت سیسپلاتین محافظت می­کند.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Protective effects of Resveratrol against chemotherapy drug Cisplatin induced hepatotoxicity in the rat

نویسنده [English]

  • ramin kaffashielahi
چکیده [English]

   Drug therapy of cancer which is carried out by natural, synthetic or biological substances is associated with complications. Cisplatin as an anticancer drug, is hepatotoxic at high doses. Oxidative stress has been proven to be involved in cisplatin-induced toxicity. Because of antioxidant potential of resveratrol, this study was conducted to assess the protective effects of resveratrol, on cisplatin-induced hepatotoxicity in the rat. Forty male Wistar rats were randomly divided into four equal groups. Group 1 was used as control. For induction of hepatic injury in groups 2-4, cisplatin (3 mg/kg) was injected once every five days intraperitoneally. Groups 3 and 4 received silymarin (100 mg/kg) and resveratrol (20 mg/kg) respectively, daily for 4 weeks via intraperitoneal route. At the end of experiment, serum levels of aspartate and alanine transaminases, lactate dehydogenase and total bilirubin, albumin and total proteins were assessed. Malondialdehyde, reduced glutathione and activities of superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and glutathione reductase were assayed in liver homogenates. Finally, the biochemical findings were matched with histopathological verification. In group 4, resveratrol significantly (p<0.001) decreased the elevated levels of serum biomarkers of hepatic injury and total bilirubin, and significantly (p<0.001) increased the reduced levels of serum albumin and total proteins. In this group, resveratrol significantly (p<0.001) decreased the lipid peroxidation and elevated the decreased values of hepatic antioxidants. Histopathologically, the changes were in agreement with biochemical findings. The results obtained showed resveratrol, because of its anti-oxidant potential, exerts a protective effect against cisplatin induced hepatotoxicity in rats.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Resveratrol
  • Cisplatin
  • Hepatotoxicity
  • Rat

مقدمه

   کبد یکی از ارگان‌های حیاتی بدن می‌باشد که نقشی برجسته و اساسی در سم‌زدایی زنوبیوتیک‌ها (xenobiotics)، آلاینده‌های محیطی و دارو‌های شیمیایی بر عهده دارد. نارسایی حادّ کبد در اثر عوامل متعددی از جمله هپاتیت‌های ویروسی، آسیب‌های توکسیک کبد توسط سموم و داروها و ایسکمی  ناشی می­شود. آسیب‌های اکسیداتیو نقشی اساسی را در صدمات بافت کبد که در اثر داروها و سموم ایجاد می­شود، بر‌عهده دارند (Rebecca, 2003).

   درمان­های امروزه سرطان عمدتاً شامل جراحی، رادیوتراپی و شیمی­درمانی یا ترکیبی از این موارد می‌باشد (Cooper et al., 2004). شیمی­درمانی از راهکارهای اصلی درمان در این زمینه به حساب می‌آید اما این روش درمان عوارضی از جمله تهوع و استفراغ، ریزش مو، خستگی، ضعف سیستم ایمنی و هجوم عوامل عفونی و اختلالات سیستمیک دارد (Lehman et al., 1993). یکی از مهم‌ترین و پرکاربردترین داروهای ضد سرطان که به‌وفور برای درمان انواع مختلف سرطان‌ها به‌کاربرده می‌شود، داروی سیسپلاتین می­باشد. این دارو دارای خاصیت قوی ضدسرطانی علیه طیف وسیعی از بدخیمی‌ها از جمله سرطان‌های تخمدان، بیضه، ناحیه گردن، مثانه، ریه و همچنین سایر تومور‌های مقاوم به رژیم‌های درمانی ضدسرطان می‌باشد (Hanigan and Devarajan, 2003). با وجود اثرات مفید بالینی سیسپلاتین در درمان سرطان، این دارو دارای اثرات جانبی توکسیک متعدد ازجمله سمیت کلیوی، عصبی  و شنوایی می‌باشد (Rabik and Dolan, 2007).     اثرات توکسیک کلیوی سیسپلاتین بسیار جدّی بوده و میزان استفاده از آن را محدود می‌نماید. همچنین، در موارد استفاده از دز‌های بالای دارو، آب‌درمانی و تجویز همزمان دارو‌های مدرّ جهت کاهش سمیت کلیوی آن، توصیه می‌گردد (Borch and Markman, 1989). در روش‌های درمانی تهاجمی، که دزهای بالای سیسپلاتین جهت مهار تومور مورد استفاده قرار می‌گیرد، اثرات توکسیک کبدی دارو نیز ظاهر می‌شود. لازم به ذکر است زمانی‌که دز‌های پائین دارو به ‌طور مکرّر مورد استفاده قرار می‌گیرد، اثرات توکسیک کبدی نیز بروز می‌کند (Lee et al., 2008; Pratibha et al., 2006). با این وجود، سمیّت کبدی سیسپلاتین کمتر مورد توجه قرار گرفته و اطلاعات اندکی در مورد پاتوژنز این آسیب در دسترس می‌باشد. گزارش شده است که استرس‌های اکسیداتیو با تولید گونه‌های فعال اکسیژن (reactive oxygen species; ROS) (Chirino and Pedraza-Chaverri, 2008)، تضعیف سیستم تدافعی آنتی‌اکسیدانی آنزیمی (Sadzuka et al., 1992) و مولکول غیرآنزیمی گلوتاتیون احیاء تغییرات اساسی هستند که در سمیّت سیسپلاتین رخ می‌دهند (Zhang and Lindup, 1993). هچنین اختلال در ساختار و عملکرد میتوکندری، وقوع آپوپتوز، اختلال در هومئوستاز کلسیم (Kawai et al., 2006; Martins et al., 2008) و درگیری ژن‌های پیش‌آماسی نظیر COX-2 و iNOS (inducible nitric oxide synthetase) ممکن است نقشی اساسی را در مکانیسم سمیّت کبدی سیسپلاتین بر عهده داشته باشند (Kim et al., 2004).

   مطالعات زیادی جهت ارزیابی اثرات محافظتی ترکیبات شیمیایی مختلف در جهت کاهش اثرات توکسیک سیسپلاتین انجام شده است، ولی متاسفانه بعضی از ترکیباتی که به­عنوان کموپروتکتور (chemoprotector) جهت کاهش اثرات سوء و توکسیک سیسپلاتین در روش­های درمانی مورد استفاده قرار می­گیرند، باعث کاهش اثرات ضد سرطانی آن می‌شوند و برخی دیگر به­طور کامل اثرات توکسیک این دارو را برطرف نمی­کنند (Aamdal et al., 1987). مواد بیولوژیک با منشأ گیاهی که شاخه‌ای از فارماکوتراپی مدرن بیماری‌ها را تشکیل می‌دهند، اثرات جانبی بسیار اندکی در بیماران به جای می‌گذارند. بنابراین، تلاش برای یافتن هر فرآورده طبیعی در این زمینه از اهمیت بالینی ویژه­ای برخوردار است. آنتی‌اکسیدان‌ها موادی هستند که، حتی در مقادیر ناچیز، می‌توانند بدن را در مقابل انواع مختلف آسیب‌های اکسیداتیو ناشی از گونه‌های فعال اکسیژن محافظت کنند (Sanches-Moreno et al., 1999).

   در این راستا، در سال‌های اخیر دستیابی به انواع جدید آنتی‌اکسیدان با منشا گیاهی جهت غلبه بر آسیب­های ناشی از عوامل شیمیایی توکسیک به‌طور جدی مورد توجه محققین بوده است.

رزوراترول (3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene) یک فیتوآلکسین طبیعی است (Jeandet et al., 1991; Oktem et al., 2010) که حداقل در 27 گونه گیاهی یافت می­شود (Jeandet et al., 1991). تحقیقات نشان داده است که رزوراترول دارای اثرات ضد التهابی، آنتی‌اکسیدانی و ضد دیابتی می­باشد (Su et al., 2006; Collodel et al., 2011). نشان داده شده است که اثرات کاهش در پراکسیداسیون لیپیدی رزوراترول بسیار قوی‌تر از سایر فنول­ها نظیر اپی‌کاتچین (epicatechin)، کاتچین (catechin) و کوئرستین (quercetin) می­باشد (Shingai et al., 2011). همچنین نشان داده شده است که رزوراترول آسیب DNA را توسط پاکسازی رادیکال­های هیدروکسیل کاهش می‌دهد. در مطالعه­ دیگری مشخص شده است که رزوراترول آپوپتوز سلول‌های زایای بیضه را به­طور معنی­داری کاهش می‌دهد (Uguralp et al., 2005).

   با توجه به اثرات مفید و متعدد درمانی رزوراترول، به‌خصوص اثرات آنتی‌اکسیدانی آن، احتمالاً این ماده توانایی آن را خواهد داشت که کبد را در مقابل اثرات اکسیداتیو سمی داروی شیمی­درمانی سیسپلاتین محافظت کند. در هر صورت با توجه به  بررسی منابع، مطالعه‌ای در رابطه اثرات حفاظتی رزوراترول در مقابل سمیّت کبدی سیسپلاتین وجود ندارد. با انجام این مطالعه خاصیت آنتی­اکسیدانی رزوراترول در محافظت از بافت کبد در مقابل سمیت سیسپلاتین مورد ارزیابی قرار می‌گیرد.

 

مواد و روش­ها

   مطالعه حاضر از نوع تجربی مداخله‌گر آزمایشگاهی می‌باشد که در سال 1393 در محل مرکز تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی تبریز انجام شد. جامعه آماری مطالعه شامل موش‌های صحرایی نر نژاد ویستار با وزن تقریبی 20 200 گرم بود که از محل پرورش و نگه‌داری حیوانات آزمایشگاهی انستیتو پاستور ایران خریداری شده بودند. به دلیل رعایت حقوق حیوانات آزمایشگاهی، از حداقل تعداد حیوانات مورد نیاز جهت انجام آزمایش استفاده شد. در این مطالعه کلیه ملاحظات اخلاقی و پروتکل‌های کار روی حیوانات آزمایشگاهی، مورد تائید کمیته نظارت بر حقوق حیوانات آزمایشگاهی مرکز تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی تبریز بود. شرایط تغذیه و نگهداری برای تمام گروه‌ها یکسان و به صورت 12 ساعت روشنایی/تاریکی و دمای 2 21 درجه سلسیوس بود. جیره غذایی یکسان و آب نیز به‌طور آزاد در دسترس قرار گرفته و پس از یک هفته عادت به شرایط جدید، آزمایش شروع شد و برای جلوگیری از سوگرایی، مراحل مختلف مطالعه به‌صورت دوسو کور انجام شد.

   برای انجام مطالعه موش‌ها به‌طور تصادفی به 4 گروه مساوی 10 تایی شامل:  1- گروه شاهد سالم،  2-گروه داروی سمّی (سیسپلاتین) 3- گروه شاهد مثبت (سیلیمارین) و 4- گروه تیمار با رزوراترول تقسیم شد.

   برای ایجاد آسیب کبدی، سیسپلاتین به‌میزان mg/kg 3 در ml/kg 10 سالین 9/0%  هر 5 روز یکبار به‌صورت داخل صفاقی (جمعاَ 5 نوبت) (Liao et al., 2008) به گروه‌های 2 تا 4 تزریق شد. به گروه 1 نیز سالین 9/0%  به همان روش تزریق شد. گروه‌ 4 داروی رزوراترول را روزانه به میزان mg/kg 20 و گروه 3 نیز به‌عنوان رفرانس، داروی سیلیمارین را به میزان mg/kg 100 در ml/kg 10 نرمال سالین با تزریق داخل صفاقی به‌مدت 4 هفته دریافت کردند. به گروه‌­های 1 و 2 نیز نرمال سالین به میزان ml/kg 10 به طور داخل صفاقی تزریق شد.

   میزان و نحوه مصرف رزوراترول بر اساس مطالعه یولاگ و همکاران (Yulug et al., 2013) و مقدار و روش مصرف سیلیمارین بر اساس مطالعه بلوچ‌نژاد مجرد و همکاران (Baluchnejadmojarad et al., 2009) تعیین شد.

   در پایان دوره تیمار، 2 میلی­لیتر خون جهت اندازه‌گیری فاکتور‌های بیوشیمیاییِ شاخص عملکرد کبد از سینوس پشت کره چشم (retro-orbital plexus) موش­های صحرایی اخذ و سرم نمونه‌های خون توسط سانتریفیوژ با سرعت 2500 دور در دقیقه و به مدت 15 دقیقه در دمای Cο30 جدا شد. سرم موش­های صحرایی جهت اندازه‌گیری مقادیر سرمی آنزیم‌های آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز و لاکتات دهیدروژناز، آلبومین، پروتئین تام و بیلی‌روبین تام، مورد استفاده قرار گرفت (Teitz, 1987).

   هم‌زمان همه موش‌‌ها با قطع سر (decapitation) به راحتی کشته شدند.  کبد موش­ها سریعاً خارج و به دو قسمت تقسیم شد. یک قسمت در سالین بسیار سرد شستشو و از آن  هموژنات 10%  در 15/1% (w/v) کلرور پتاسیم تهیه شد. هموژنات با سرعت ×g7000 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سلسیوس سانتریفیوژ شد و محلول شناور  جهت سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدی از طریق اندازه‌گیری مقدار مالون‌دی‌آلدئید (malondialdehyde) و هم‌چنین برای اندازه­گیری فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدانی سوپراکسید ­دیسموتاز (superoxide dismutase)، کاتالاز (catalase)، گلوتاتیون پرکسیداز (glutathione peroxidase) و گلوتاتیون ردوکتاز (glutathione reductase) مورد استفاده قرار گرفت.

   پراکسیداسیون چربی در کبد با روش رنگ­سنجی به‌وسیله اندازه­گیری مالون­دی­آلدئید در قالب TBARS (thiobarbituric acid reacting substances) طبق روش فراگا و همکاران (Fraga et al., 1988) انجام شد. به طور خلاصه، 1/0 میلی لیتر هموژنات بافتی با 2 میلی لیتر راژین TBA-trichloroacetic acid—Hcl reagent (37% TBA ، 25/0 مول HCL و 15% TCA، به نسبت 1:1:1) مخلوط و پس از 15 دقیقه حمام بخار، خنک گردید و در g×3500 به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شد. شدت جذب محلول شناور شفاف در nm 535 در مقابل بلانک اندازه­گیری شد. مقادیر به صورت نانومول/100 گرم بافت بیان شدند.  

   فعالیت سوپراکسید دیسموتاز توسط روش نیشیکیمی و همکاران (Nishikimi et al., 1972) تعیین گردید. در حدود 5 میکروگرم از پروتئین­های تام هموژنات­ کبد با بافر پیروفسفات سدیم، PMT (phenazine methosulfate) و NBT (nitro-blue tetrazolium) مخلوط گردید. واکنش با افزودن NADH (nicotinamide-adenine dinucleotide) آغاز شد. مخلوط واکنش در دمای 30 درجه سلسیوس به مدت 90 ثانیه انکوبه و با افزودن 1 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال متوقف گردید. شدت جذب مخلوط رنگزای تشکیل شده در nm560 اندازه­گیری گردید. هر واحد از فعالیت سوپراکسید دیسموتاز به صورت غلظت آنزیم مورد نیاز برای ممانعت از تولید رنگ تا 50 درصد در 1 دقیقه، تحت شرایط مطالعه، تعیین شد.

   فعالیت کاتالاز توسط روش کلایبورن (1985 Claiborne,) و براساس تجزیه پراکسید هیدروژن در  nm240، مورد سنجش قرار گرفت. به طور خلاصه، مخلوط مورد سنجش متشکل از 95/1 میلی لیتر بافرفسفات (7M, pH=  05/0)، 1 میلی­لیتر پرکسید هیدروژن (M 019/0) و 05/0 میلی‌لیتر PMS (10%) در حجم نهایی 3 میلی‌لیتر بود. تغییرات در جذب، در nm240 اندازه‌گیری گردید. در نهایت نتیجه به شکل "فعالیت کاتالاز در دقیقه" محاسبه شد.

   فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز با استفاده از روش روتروک و همکاران (et al., 1973 Rotruck) و بر اساس واکنش ذیل مورد سنجش قرار گرفت.

H2O2 + 2GSH (گلوتاتیون احیاء) →2H2O +GSSG (گلوتاتیون اکسید)

   گلوتاتیون پراکسیداز، در هموژنات بافتی، گلوتاتیون را اکسیده کرده که به طور هم زمان پراکسید هیدروژن به آب احیاء می­گردد. این واکنش پس از 10 دقیقه توسط تری‌کلرواستیک اسید متوقف و گلوتاتیون باقیمانده توسط محلول DTNB (dithiobis nitrobenzoic acid) مجدداً فعال گردیده و منجر به تشکیل ترکیب رنگی می­گردد که با اسپکتروفتومتر در  nm420 اندازه­گیری شد. مخلوط واکنشگر متشکل از 2/0 میلی‌لیتر EDTA (ethylenediamine tetra-acetic acid)  mM8/0، 1/0 میلی‌لیتر آزید سدیم (sodium azide)  mM10، 1/0 میلی‌لیتر پراکسید هیدروژن  mM5/2، 2/0 میلی‌لیتر هموژنات می­باشد که در 37 درجه ‌ سلسیوس به مدت 10 دقیقه انکوبه گردید. واکنش با افزودن 5/0 میلی‌لیتر تری‌کلرواستیک اسید 10 درصد متوقف و لوله­ها با 2000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. 3 میلی‌لیتر دی سدیم هیدروژن mM 8/0 و 1/0 میلی‌لیتر DTNB 04/0 درصد به محلول شناور افزوده شده و بلافاصله رنگ حاصله در nm420 اندازه­گیری شد. فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز به صورت میکرومول گلوتاتیون اکسید/دقیقه/میلی‌گرم پروتئین بیان گردید.

   فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز با استفاده از روش مهنداس و همکاران (et al., 1984  Mohandas) بر اساس واکنش ذیل مورد سنجش قرار گرفت.

NADPH + H+ + GSSG → NADP+ + 2GSH

   در حضور گلوتاتیون ردوکتاز، گلوتاتیون اکسیده، احیاء گردیده و هم زمان، NADPH به NADP+ اکسیده می‌شود. فعالیت آنزیم در دمای اتاق توسط سنجش میزان ناپدید شدن NADPH/ دقیقه در nm340، با اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد.

   قسمت دیگر از بافت کبد جهت انجام بررسی­های هیستوپاتولوژی در فرمالین بافری 10 درصد پایدار شد. از نمونه‌های فوق با استفاده از شیوه‌های رایج پاساژ بافت و تهیه مقاطع هیستوپاتولوژی، برش‌هایی با ضخامت 5 میکرون و با روش رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین تهیه شد. شدت آسیب کبد بر اساس یک مقیاس نیمه کمی (semiquantitative scale) و دوسو کور طبق روش ارائه شده توسط فری و همکاران ارزیابی گردید.  شدت آسیب، از صفر تا 4  (صفر: عدم وجود آسیب، 1: حداقل آسیب، 2: آسیب ملایم، 3: آسیب متوسط و 4: آسیب شدید) رتبه‌بندی شد (Frei et al., 1984). کلیه درجه‌‌بندی‌ها با بزرگنمایی 100× و در 5 میدان میکروسکوپی از هر برش، به‌طور تصادفی، با میکروسکوپ نوری مدل نیکون (ECLIPSE E200، ساخت کشور ژاپن) انجام گردید.

   برای تحلیل داده‌ها از نرم‌افزار SPSS-17 استفاده شد. داده‌های به‌دست آمده کمّی، به صورت میانگین±انحراف استاندارد (mean±SEM.) ارائه و اختلاف معنی‌دار بین گروه‌ها توسط آزمون آماری آنالیز واریانس یک­طرفه (ANOVA) و آزمون تعقیبی توکی (tukey) مورد بررسی قرار گرفت. در مورد داده‌های هیستوپاتولوژی برای مقایسه نتایج‌ درجه‌‌بندی شده آسیب بافت کبد اختلاف معنی‌داری توسط آزمون ناپارامتری کروسکال والیس (kruskal-wallis) و سپس آزمون یو من- ویتنی (mann-whitney u test) برای ارزیابی مقایسه‌ای دو به دو، مورد استفاده قرار گرفت. اختلافات در سطح 05/0p< معنی‌دار تلقی شدند.

 

یافته­ها

   در موش‌های گروه 2، داروی سیسپلاتین سطوح سرمی آنزیم­های آلانین ‌آمینوترانسفراز، آسپارتات ‌آمینوترانسفراز و لاکتات دهیدروژناز و بیلی‌روبین تام سرم را در مقایسه با گروه 1 به‌طور معنی‌داری (001/0p<) افزایش و میزان پروتئین تام و آلبومین سرم را به‌طور معنی‌داری (001/0p<) کاهش داد. در گروه  3، داروی سیلیمارین و در گروه­ 4، رزوراترول سطوح سرمی افزایش یافته آنزیم‌های شاخص آسیب کبد و بیلی‌روبین تام سرم در اثر سیسپلاتین را به‌طور معنی‌دار (001/0p<) و تا حدّ طبیعی کاهش و مقادیر کاهش یافته پروتئین تام و آلبومین سرم در اثر سیسپلاتین را به‌طور معنی‌دار (001/0p<) و تا سطوح طبیعی خود (Kabir and Pazdezh, 2002) افزایش دادند (جدول 1).

   در گروه 2، سیسپلاتین مقادیر گلوتاتیون احیاء و آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز را در مقایسه با گروه 1، به طور معنی­داری (001/0p<) کاهش و میزان مالون‌‎دی‌آلدئید را به‌طور معنی­داری (001/0p<) افزایش داد. در گروه 3، داروی سیلیمارین و در گروه­ 4، رزوراترول مقادیر گلوتاتیون احیاء و آنزیم‌های آنتی اکسیدانی فوق را که در اثر سیسپلاتین کاهش یافته بود، به طور معنی­دار (001/0p<) و تا حد طبیعی خود افزایش دادند. در گروه  3، سیلیمارین و در گروه­ 4، رزوراترول مقدار افزایش‌یافته مالون­دی­آلدئید در اثر سیسپلاتین را به‌طور معنی­دار (001/0p<) و تا حد طبیعی خود کاهش دادند (جدول 2).

   آسیب‌ بافتی گروه‌های مورد مطالعه در جدول 3، درجه­‌بندی و مقایسه گردیده است. در مشاهدات ریزبینی بافت کبد موش­های گروه‌ 1، ساختار بافت کبد سالم و طبیعی بود (شکل 1). در نمونه‌های بافتی کبد موش­های گروه 2 (سیسپلاتین)، تغییرات دژنراتیو متوسط تا شدید در نواحی مرکز لوبولی که تا نواحی پورتال نیز کشیده شده بود، مشاهده گردید. در موارد شدید، نکروز سلول‌های کبدی در اطراف وریدچه مرکزی نیز مشاهده گردید. افزایش منتشر سلول‌های کوپفر همراه با ارتشاح تک‌هسته‌ای‌ها در اطراف وریدچه­های مرکزی و  برخی فضاهای پورتال و پرخونی سینوزوئیدها در این گروه قابل مشاهده بود (شکل 2). در گروه‌های 3 و 4، آسیب بافتی فقط به شکل تغییرات دژنراتیو خفیف در تعدادی از موش‌ها مشاهده گردید (شکل­های 3 و 4) که از لحاظ آماری اختلاف معنی‌داری بین این گروه‌ها و گروه شاهد برآورد نگردید (جدول 3).

 

 

جدول 1- تاثیر رزوراترول بر فراسنجه­های بیوشیمیایی سرم موش ‌صحرایی در آسیب کبدی ناشی از سیسپلاتین

گروه­ها

فراسنجه­های بیوشیمیایی

 

آلانین ‌آمینوترانسفراز

(U/L)

آسپارتات ‌آمینوترانسفراز

(U/L)

لاکتات دهیدروژناز

 (U/L)

بیلی‌روبین تام سرم

(mg/dl)

آلبومین

 (g/dl)

پروتئین ‌تام‌ سرم

(g/dl)

1

25/2±79/51 b

b82/1±85/64

b60/26±46/653

b03/0±79/0

b41/0±26/4

b69/0±34/8

2

54/3±42/73acd

acd97/3±14/97

acd85/33±27/1051

acd07/0±42/1

acd32/0±75/2

acd58/0±21/5

3

36/2±87/52b

b46/1±16/64

b48/30±51/679

b05/0±85/0

b38/0±20/4

b43/0±46/7

4

b53/2±27/53

b27/2±86/65

b73/29±92/684

b04/0±83/0

b35/0±22/4

b51/0±58/7

           مقادیر به­صورت میانگین ± انحراف استاندارد برای 10 سر موش صحرایی در هر گروه ارائه شده است. a: اختلاف معنی‌دار با گروه 1،b : اختلاف معنی‌دار با گروه 2، c: اختلاف  

          معنی‌دار با گروه 3، d: اختلاف معنی‌دار با گروه 4 (05/0p<).

 

جدول 2- تاثیر رزوراترول بر فعالیت آنتی اکسیداتیوی کبد موش ‌صحرایی‌در آسیب ناشی از سیسپلاتین

گروه‌ها

فراسنجه­های بیوشیمیایی

 

گلوتاتیون احیاء

(μg/mg protein)

مالون‌دی‌آلدئید

(nmol/g protein)

سوپراکسید دیسموتاز

(U/mg protein)

کاتالاز

(U/mg protein)

گلوتاتیون پراکسیداز

(U/mg protein)

گلوتاتیون ردوکتاز

 (U/mg protein)

1

83/0±85/8 b

16/0±85/3 b

b53/0±54/12

b10/3±23/69

b75/1±54/23

b14/5±81/125

2

57/0±56/4acd

32/0±54/5acd

acd61/0±82/9

acd11/2±51/44

acd13/1±17/17

acd72/2±12/86

3

75/0±15/8b

18/0±89/3b

b72/0±54/13

b64/2±53/65

b24/1±65/22

b55/3±94/118

4

b66/0±38/8

b17/0±92/3

b43/0±90/12

b51/2±82/67

b37/1±85/21

b62/4±72/120

                مقادیر به­صورت میانگین ± انحراف استاندارد برای 10 سر موش صحرایی در هر گروه ارائه شده است. a: اختلاف معنی­دار با گروه 1،b : اختلاف معنی­دار با گروه 2، c:

                اختلاف معنی­دار با گروه 3، d: اختلاف معنی­دار با گروه 4 (05/0p<).

 

 

 

جدول 3- تاثیر رزوراترول بر آسیب بافت کبد موش ‌صحرایی‌ ناشی از سیسپلاتین

گروه­ها

تیمار

درجه آسیب بافت

1

نرمال‌سالین

a0/0±0/0

2

سیسپلاتین

b52/0±93/2

3

سیسپلاتین+ سیلیمارین

a07/0±15/0

4

سیسپلاتین+ رزوراترول

a14/0±21/0

                                                     مقادیر به­صورت میانگین ± انحراف استاندارد برای 10 سر موش صحرایی در هر گروه ارائه شده است.

a                                                     و b: حروف غیر مشابه نشانگر اختلاف معنی‌دار می‌باشد (05/0p<).

 

 

شکل 1- نمای ریز‌بینی از بافت کبد یک موش­ صحرایی از گروه شاهد سالم که ساختار آن طبیعی است (هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×400).

 

 

شکل 2- نمای ریز‌بینی از بافت کبد یک موش­ صحرایی از گروه تیمار با سیسپلاتین که در آن پرخونی وریدچه مرکزی و نکروز هپاتوسیت‌ها در اطراف وریدچه مرکزی مشخص می‌باشد (هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×400).

 

 

 

 

شکل 3- نمای ریز‌بینی از بافت کبد یک موش­ صحرایی از گروه شاهد مثبت که نسبتاً سالم به‌نظر رسیده و تغییر پاتولوژیک خاصی ندارد (هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×400).

 

شکل 4- نمای ریز‌بینی از بافت کبد یک موش­ صحرایی از گروه تیمار با رزوراترول که تغییر پاتولوژیک قابل ملاحظه­ای در آن مشاهده نمی­شود (هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی ×400).

 


بحث و نتیجه­گیری      

در مطالعه ما، سیسپلاتین باعث افزایش معنی‌دار مقادیر سرمی آنزیم‌های آسپارتات آمینوترانسفراز، آلانین آمینوترانسفراز و لاکتات دهیدروژناز و بیلی‌روبین تام و کاهش معنی‌دار پروتئین تام و آلبومین سرم در مقایسه با گروه شاهد سالم شد. تغییرات معنی­دار در مقادیر سرمی فراسنجه­های مذکور متعاقب تیمار با سیسپلاتین که نشان­دهنده آسیب کبد می­باشند، قبلاً توسط یوسف و همکاران گزارش شده است (Yousef et al., 2009). در بررسی حاضر، یافته­های آسیب­شناسی بافتی نیز نشان‌دهنده آسیب شدید کبد در اثر سیسپلاتین بود که با نتایج مطالعه ایسری و همکاران هم‌خوانی دارد (Iseri et al., 2007).

   در ارزیابی آسیب کبد، سنجش سطوح آنزیم‌هایی نظیر آسپارتات و آلانین آمینوترانسفراز و لاکتات دهیدروژناز به‌طور وسیع مورد استفاده قرار می‌گیرد. وقوع نکروز یا آسیب غشاء سلول باعث رها شدن این آنزیم‌ها در خون می‌شود. از سوی دیگر، سطح سرمی بیلی‌روبین، آلبومین و پروتئین تام با عملکرد سلول‌های کبدی در ارتباط می‌باشد  (Stockham and Scott, 2002).

   در مطالعه ما، تیمار با رزوراترول، به­طور معنی­داری مانع از بروز اثرات سمّی سیسپلاتین در کبد موش‌های صحرایی گردید. این اثر احتمالاً به دلیل محافظت غشاء سلول و ممانعت از نشت آنزیم‌های داخل آن حاصل می­گردد (Thabrew et al., 1987). کنترل موثر سطوح بیلی‌روبین، آلبومین و پروتئین تام سرم، بهبود زود هنگام مکانیسم‌های عملکردی و ترشحی سلول‌های کبدی را نشان می­دهد. اثرات مفید فوق را می­توان به اثرات آنتی‌اکسیدانی و کاهش استرس­های اکسیداتیو توسط رزوراترول مربوط دانست(Franciscoa et al., 2009).رزوراترول با جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدی منجر به تثبیت غشاء­های سلولی شده و مانع از نشت آنزیم­ها می‌گردد (Yousef et al., 2009). در این بررسی، سیلیمارین تاثیر بسیار خوبی را بر تغییرات آنزیم­های شاخص کبدی ناشی از سیسپلاتین داشت که از این لحاظ با نتایج بررسی منصور و همکاران هم­خوانی دارد (Mansour etal., 2006).

   در مطالعه ما، افزایش مالون­دی­آلدئید و کاهش گلوتاتیون احیاء در بافت کبد، متعاقب مصرف سیسپلاتین در موش صحرایی، نشان­ می­دهد که آسیب اکسیداتیو ناشی از رادیکال­های آزاد، یکی از مکانیسم­های احتمالی در آسیب کبدی سیسپلاتین می­باشد. در مطالعه پارتیبها و همکاران وی پراکسیداسیون لیپیدی و تخلیه گلوتاتیون احیاء در بافت کبد موش صحرایی در اثر سیسپلاتین با نتایج مطالعه ما همخوانی دارد (Partibha et al., 2006). گلوتاتیون احیاء جزء مهمی از سیستم آنتی­اکسیدانی غیرآنزیمی بوده و نقش مهمی را در کنترل اثرات سمی سیسپلاتین بر عهده دارد (Hanigan and Devarajan, 2003). بنابراین، کاهش میزان گلوتاتیون احیاء می­تواند به عنوان عاملی مستقیم در پراکسیداسیون چربی ناشی از سیسپلاتین مطرح باشد. نقش استرس اکسیداتیو و مداخله گونه­های فعال اکسیژن در سمیت کبدی سیسپلاتین به اثبات رسیده است (Iraz et al., 2006).

   بررسی­های کُج و همکاران نشان داده است که سیسپلاتین مانع از فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز شده و میزان مالون­دی­آلدئید را در کبد موش­های صحرایی افزایش می­دهد (Koc et al., 2005). در مطالعه ما نیز تغییراتی در سسیتم تدافعی آنتی­اکسیدانی و میزان مالون­دی­آلدئید بافت کبد موش­های صحرایی متعاقب تیمار با سیسپلاتین مشاهده شد که با نتایج مطالعه ایشان همسو می­باشد. کاهش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز شاخصی حساس برای آسیب سلول­های کبدی است. این آنزیم یکی از مهم­ترین عوامل در سیستم تدافعی آنتی­اکسیدانی آنزیمی است. سوپراکسید دیسموتاز آنیون سوپراکسید را با تبدیل به پراکسید هیدروژن پاکسازی کرده و بدین ترتیب اثرات سمّی آن را کاهش می­دهد (Curtis et al., 1972). در مطالعه حاضر، میزان سوپراکسید دیسموتاز در موش­های صحرایی دریافت‌کننده سیسپلاتین به دلیل تشکیل فراوان آنیون­های سوپراکسید، به طور معنی­داری کاهش یافت که در پی آن فعالیت آنزیم­های پراکسید هیدروژن یعنی کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز نیز در این حیوانات به طور معنی­داری کاهش پیدا کرد. غیرفعال شدن سوپراکسید دیسموتاز توسط آنیون­های افزایش یافته سوپراکسید، منجر به غیرفعال شدن آنزیم­های کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز می­شود. کاتالاز با تجزیه پراکسید هیدروژن بافت­ها را در برابر رادیکال­های فعال هیدروکسیل محافظت می­کند. بنابراین، کاهش فعالیت کاتالاز ممکن است به برخی اثرات مخرب ناشی از رادیکال سوپراکسید و پراکسید هیدروژن منجر گردد (Chance et al., 1952). گلوتاتیون ردوکتاز یک آنزیم سیتوزولی کبدی است که در کاهش گلوتاتیون اکسید (GSSG)، به عنوان محصول نهایی فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز روی گلوتاتیون احیاء (GSH)، دخالت دارد (Naik and Panda, 2008).

   در مطالعه ما، مصرف رزوراترول مانع از کاهش آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز در اثر سیسپلاتین شد که این ممکن است در اثر پاکسازی رادیکال­ها توسط رزوراترول باشد که باعث حفظ و بقاء این آنزیم­ها شده است. هم­چنین، متعاقب مواجهه با سیسپلاتین کاهش قابل توجهی در میزان گلوتاتیون پراکسیداز ایجاد شد که منجر به دسترسی گلوتاتیون ردوکتاز به سوبسترا شده و بدین ترتیب فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز کاهش یافت. به نظر می­رسد که رزوراترول در کنار سیسپلاتین فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز را مجدداً برقرار نموده که مصرف گلوتاتیون اکسید را جهت تشکیل گلوتاتیون احیاء و افزایش سم­زدایی متابولیت­های فعال توسط کونژوگاسیون با گلوتاتیون احیاء برقرار می­کند. نتایج بررسی حاضر، گزارش سایر محققین را در خصوص اثرات آنتی­اکسیدانی و زدایش رادیکال آزاد رزوراترول مورد تائید قرار می­دهد (Su et al., 2006; Collodel et al., 2011).   

   نتایج مطالعه ما در مورد اثرات آنتی­اکسیدانی سیلیمارین نیزبا یافته­های راماکریشنان و همکاران (Ramakrishnan et al., 2006) و پرادیپ و همکاران (Pradeep et al., 2007) مطابقت دارد. بنابراین، به جرأت می­توان ادعا نمود که سیلیمارین با خصوصیات آنتی­اکسیدانی خود منجر به جبران فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی مزبور شده است. قابل توجه این­که در مطالعه ما، بین رزوراترولوسیلیمارین از لحاظ تاثیر بر فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز، گلوتاتیون ردوکتاز و میزان گلوتاتیون احیاء و مالون­دی­آلدئید تفاوت معنی­داری وجود نداشت.

   با توجه به مجموعه فوق­الذّکر، رزوراترول احتمالاً با خواص آنتی­اکسیدانی خود، کبد را در برابر اثرات سمّی اکسیداتیو سیسپلاتین محافظت می­کند. بنابراین، پس از انجام کارآزمایی‌های شاهدار اتفاقی و حصول نتایج مثبت، رزوراترول می‌تواند به‌عنوان یک آنتی­اکسیدان با منشا طبیعی جهت پیشگیری از آسیب­های اکسیداتیو کبد ناشی از سیسپلاتین در بیماران سرطانی مورد استفاده قرار گیرد.

  • Aamdal, S., Fodstad, O. and Pihl A. (1987). Some procedures to reduce cis-platinum toxicity reduce antitumour activity. Cancer Treatment Reviews, 14(3-4): 389-395.
    • Baluchnejadmojarad, T., Roghani, M., Homayounfar, H. and Khaste Khodaie, Z. (2009). Protective effects of chronic administration of silymarin on blood glucose and lipids and oxidative stress in diabetic rats. Journal of Semnan University of Medical Sciences, 10(2): 143-150.
    • Borch, R.F. and Markman, M. (1989). Biochemical modulation of cisplatin toxicity. Pharmacology & Therapeutics, 41: 371-380.
    • Chance, B., Greenstein, D.S. and Roughton, R.J.W. (1952). The mechanism of catalase action. 1. Steady-state analysis. Archives of Biochemistry and Biophysics, 37(2):301-321.
    • Chirino, Y.I. and Pedraza-Chaverri, J. (2009) Role of oxidative and nitrosative stress in cisplatin-induced nephrotoxicity. Experimental and Toxicologic Pathology, 61(3):223-242.
    • Claiborne, A. (1985). Catalase activity. In: Boca Raton FL, editor. CRC Handbook of methods for oxygen radical research. Florida: CRC Press, Boca Raton, pp: 283-284.
    • Collodel, G., Federicoa, M., Gerniniania, S., Martini, B. and Bonechi, E. (2011). Effect of trans-resveratrol on induced oxidative stress in human sperm and in rat germinal cells. Reproductive Toxicology, 31: 239-246.
    • Cooper, J.S., Pajak, T.F., Forastiere, A.A., Jacobs, J., Campbell, B.H., Saxman, S.B., et al. (2004). Postoperative concurrent radiotherapy and chemotherapy for high-risk squamous-cell carcinoma of the head and neck. New England Journal of Medicine, 350(19): 1937-1944.
    • Curtis, S.J., Mortiz, M. and Sondgrass, P.J. (1972). Serum enzymes derived from liver cell fractions. I. The response to carbon tetrachloride intoxication in rats. Gastroentrology, 62(1):84-92.
    • Fraga, C.G., Leibouitz, B.E. and Toppel A.L. (1988). Lipid peroxidation measured as TBARS in tissue slices: characterization and comparison with homogenates and microsomes. Free Radical Biology and Medicine, 4: 155-161.
    • Franciscoa, M., Morenob, D.A., Carteaa, M.E., Ferreresb, F., Viguerab, C.G. and Velascoa, P. (2009). Simultaneous identification of glucosinolates and phenolic compounds in a representative collection of vegetable Brassica rapa. Journal of Chromatography A, 1216(38): 6611-6619.
    • Frei, A., Zimmermann, A. and Weigand, K. (1984). The N-terminal propeptide of collagen type III in serum reflects activity and degree of fibrosis in patients with chronic liver disease. Hepatology, 4(5): 830-834.
    • Hanigan M.H. and Devarajan, P. (2003). Cisplatin nephrotoxicity: molecular mechanisms. Cancer Therapeutics, 1:47-61.
    • Iraz, M., Ozerol, E., Gulec, M., Tasdemir, S., Idiz, N., Fadillioglu, E., et al. (2006). Protective effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) administration on cisplatin-induced oxidative damage to liver in rat. Cell Biochemistry and Function, 24(4): 357-361.
    • Iseri, S., Ercan, F., Gedik, N., Yuksel, M. and Alican, I. (2007). Simvastatin attenuates cisplatin-induced kidney and liver damage in rats. Toxicology, 230(2-3): 256-264.
    • Jeandet, P., Bessis R. and Gautheron, B. (1991). The production of resveratrol (3, 5, 4'-trihydroxystilbene) by grape berries in different developmental stages. American Journal of Enology and Viticulture, 42: 41-46.
    • Kabir, F. and Pazdezh, P. (2002). Handbook of Normal Values in Domestic Animals. Tehran: Norbakhsh, pp: 16-262.
    • Kawai, Y., Nakao, T., Kunimura, N., Kohda, Y. and Gemba, M. (2006). Relationship of intracellular calcium and oxygen radicals to Cisplatin-related renal cell injury. Journal of Pharmacological Sciences, 100: 65-72.
    • Kim, S.H., Hong, K.O., Chung, W.Y., Hwang, J.K. and Park, K.K. (2004). Abrogation of cisplatin-induced hepatotoxicity in mice by xanthorrhizol is related to its effect on the regulation of gene transcription. Toxicology and Applied Pharmacology, 196: 346-355.
    • Koc, A., Duru, M., Ciralik, H., Akcan, R. and Sogut, S. (2005). Protective agent, erdosteine, against cisplatin-induced hepatic oxidant injury in rats. Molecular and Cellular Biochemistry, 278(1-2): 79-84.
    • Lee, K.J., Choi, J.H., Khanal, T., Hwang, Y.P., Chung, Y.C. and Jeong, H.G. (2008). Protective effect of caffeic acid phenethyl ester against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice. Toxicology, 248: 18-24.
    • Lehman, T.A., Modali, R., Boukamp, P., Stanek, J., Bennett, W.P., Welsh, J.A., et al. (1993). p53 mutations in human immortalized epithelial cell lines. Carcinogenesis, 14(5): 833-839.
    • Liao, Y, Lu, X., Lu, C., Li, G., Jin, Y. and Tang, H. (2008). Selection of agents for prevention of cisplatin-induced hepatotoxicity. Pharmacological Research, 57(2): 125-131.
    • Mansour, H.H., Hafez, H.F. and Fahmy, N.M. (2006). Silymarin modulates cisplatin-induced oxidative stress and hepatotoxicity in rats. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 39: 656-661.
    • Martins, N.M., Santos, N.A., Curti, C., Bianchi, M.L. and Santos, A.C. (2008). Cisplatin induces mitochondrial oxidative stress with resultant energetic metabolism impairment, membrane rigidification and apoptosis in rat liver. Journal of Applied Toxicology, 28: 337-344.
    • Mohandas, J., Marshall, J.J., Duggin, G.G., Horvath, J.S.L. and Tille, D.G. (1984). Low activities of glutathione-related enzymes as factors in the genesis of urinary bladder cancer. Cancer, 44: 5086-5091.
    • Naik, S.R. and Panda, V.S. (2008). Hepatoprotective effect of Ginkgoselect Phytosome in rifampicin induced liver injurym in rats: Evidence of antioxidant activity. Fitoterapia, 79(6): 439-445.
    • Nishikimi, M., Rao, N.A. and Yagi, K. (1972). The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulphate and molecular oxygen. Biochemical and Biophysical Research Communications, 46: 849-854.
    • Oktem, G., Uysal, A., Oral, O., Sezer, E.D. and Olukman M. (2010). Resveratrol attenuates doxorubicin-induced cellular damage by modulating nitric oxide and apoptosis. Experimental and Toxicologic Pathology, 64: 471-479.
    • Pradeep, K., Mohan, C.V.R., Gobianand, K. and Karthikeyan, S. (2007). Silymarin modulates the oxidant–antioxidant imbalance during diethylnitrosamine induced oxidative stress in rats. European Journal of Pharmacology, 560: 110-116.
    • Pratibha, R., Sameer, R., Rataboli, P.V., Bhiwgade, D.A. and Dhume, C.Y. (2006). Enzymatic studies of cisplatin induced oxidative stress in hepatic tissue of rats. European Journal of Pharmacology, 532(3): 290-293.
    • Rabik, C.A. and Dolan, M.E. (2007). Molecular mechanisms of resistance and toxicity associated with platinating agents. Cancer Treatment Reviews, 33: 9-23.
    • Ramakrishnan, G., Raghavendran, H.R., Vinodhkumar, R. and Devaki, T. (2006). Suppression of N-nitrosodiethylamine induced hepatocarcinogenesis by silymarin in rats. Chemico-Biological Interactions, 161: 104-114.
    • Rebecca, T. (2003). Hepatoprotection via the Il-6/Stat3 pathway. Journal of Clinical Investigation, 112: 978-980.
    • Rotruck, I.T., Pope, A.L., Ganther, H.E., Swanson, A.B., Hafeman, D.G. and Hoekstra, W.G. (1973). Selenium: Biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science, 179: 588-590.
    • Sadzuka, Y., Shoji, T. and Takino, Y. (1992). Effect of cisplatin on the activities of enzymes which protect against lipid peroxidation. Biochemical Pharmacology, 43: 1872-1875.
    • Sanchez-Moreno, C., Larrauri, J.A. and Saura-Calixto, F. (1999). Free radical scavenging capacity and inhibition of lipid oxidation of wines, grape juices and related polyphenolic constituents. Food Research International, 32: 407-412.
    • Shingai, Y., Fujimoto, A., Nakamura, M. and Masuda, T. (2011). Structure and function of the oxidation products of polyphenols and identification of potent lipoxygenase inhibitors from fe-catalyzed oxidation of resveratrol. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59: 8180-8186.
    • Stockham, S.L. and Scott, M.A. (2002). Fundamentals of Veterinary Clinical Pathology. Ames: Iowa State University Press, pp: 434-459.
    • Su, H.C., Hung, L.M. and Chen, J.K. (2006). Resveratrol, a red wine antioxidant, possesses an insulin-like effect in streptozotocin-induced diabetic rats. American Journal of Physiology- Endocrinology and Metabolism, 290: E1339-E1346.
    • Teitz, N.W. (1987). Fundamentals of Clinical Chemistry. Philadelphia: NB Saunders Company, pp: 638.
    • Thabrew, M.I., Joice, P.D. and Rajatissa, W. (1987). A comparative study of the efficacy of Pavetta indica and Osbeckia octanda in the treatment of liver dysfunction. Planta Medica, 53(3): 239-241.
    • Uguralp, S., Usta, U. and Mizrak, B. (2005). Resveratrol may reduce apoptosis of rat testicular germ cells after experimental testicular torsion. European Journal of Pediatric Surgery, 15: 333-336.
    • Yousef, M.I., Saad, A.A. and El-Shennawy, L.K. (2009). Protective effect of grape seed proanthocyanidin extract against oxidative stress induced by cisplatin in rats. Food and Chemical Toxicology, 47(6): 1176-1183.
    • Yulug, E., Tured, S., Alver, A., Kutlu, O., Karaguzel, E. and Kahraman C. (2013). Effects of Resveratrol on Testis Damage in Streptozotocin Induced Diabetic Rats. Journal of Animal and Veterinary Advances, 12(6): 747-753.
    • Zhang, J.G. and Lindup, W.E. (1993). Role of mitochondria in cisplatin-induced oxidative damage exhibited by rat renal cortical slices. Biochemical Pharmacology, 45: 2215-2222.