اثرات افزودن سیستئامین و ویتامین E بر برخی از فاکتورهای میکروسکوپیک اسپرم گاومیش بعد از یخ‌گشایی

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شبستر، استادیار گروه علوم درمانگاهی، شبستر، ایران.

2 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شبستر، استادیار گروه علوم پایه، شبستر، ایران.

چکیده

تحقیق حاضر به منظور بررسی تاثیر ویتامین E و سیستئامین بر کیفیت اسپرم پس از یخ­زدایی در گاومیش انجام گردید. برای این منظور تعداد 20 انزال از چهار رأس گاومیش نر جمع‌آوری شد. نمونه‌های منی با کیفیت عالی و داشتن بیش از 70 درصد اسپرماتوزویید با تحرک رو به جلو در دمای 37 درجه سلسیوس با رقیق‌کننده‌های تجاری بایوکسل رقیق و پس از مرحله خنک شدن در دمای چهار درجه سلسیوس ظرف مدت دو ساعت و اعمال زمان تعادل، متعاقب افزودن75/0، 5/1، 2 و 5  میلی­مول ویتامین E و 5/7، 5/12، 15 و 20 میلی­مول سیستئامین به ازای هر 90 میلی‌لیتر رقیق کننده، در پایت‌های 5/0 میلی‌لیتری فرانسوی بسته­بندی شد و با اعمال زمان انجماد مشخص قبل از ورود به ازت مایع، منجمد و داخل ظروف حاوی ازت مایع نگه‌داری شدند. پس از 72 ساعت، یخ‌گشایی نمونه پایوت‌های منجمد مورد نظر در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 40 ثانیه صورت گرفت. میزان تحرک و برخی فراسنجه‌های کیفی نمونه‌های مورد نظر پس از یخ­گشایی با استفاده از سیستم ارزیابی کامپیوتری الگوی تحرک اسپرم مورد بررسی قرار گرفت. به طور کلی نتایج به‌دست آمده در این تحقیق نشان دادند، افزودن 20 میلی‌مول سیستئامین و 5/1 میلی­مول ویتامین E به رقیق کننده‌ تجاری بایوکسل باعث افزایش میزان تحرک و برخی فراسنجه‌های کیفی اسپرم گاومیش پس از یخ­زدایی شد (05/0>p).
نشریه آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی، 1392، دوره7، شماره 4، پیاپی 28، صفحات 276-268

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Effects of cysteamine and vitamin E addition to semen extender on post-thawed microscopic sperm parameters of buffalo bulls

نویسندگان [English]

  • rahim beheshti 1
  • jamshid ghiyasi 2
چکیده [English]

   This study was designed to investigate the effect of cysteamine and vitamin E on post thaw buffalo bull's sperm quality. For this purpose, 20 ejaculates from four buffalo bulls possessing more than 70% visual sperm motility were diluted at 37◦C in BioXcell® extender. The diluted semen was cooled to 4◦C within 2 hours, equilibrated at 4◦C following the addition of (0.75, 1.5, 2 and 5 mM) of vitamin E and (7.5, 12.5, 15 and 20 mM) cysteamine per 90 ml, filled in 0.5 ml French straws and were subjected to cooling condition before being plunged into liquid nitrogen. Semen was thawed at 37◦C for 40 seconds after 72 hours of storage inside liquid nitrogen .Post-thaw sperm motility and some qualitative parameters of each frozen semen sample were assessed by using computer assisted semen analyzer (CASA). In general, the results showed that the addition of 1.5 mM vitamin E and 20 mM cysteamine in the commercial diluents BioXcell extender for freezing buffalo semen increased the motility of spermatozoa and some qualitative parameters to post-thawed buffalo sperm.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Semen freezing
  • Buffalo
  • vitamin E
  • Cysteamine

مقدمه

   گاومیش اهلی، بوبالوس بوبالیس، یک گونه متمایز در خانواده بوویدا است. جمعیت گاومیش به طور پیوسته افزایش می‌یابد و بیش از 170 میلیون رأس تخمین زده می‌شود (FAO, 2004). طبق آماری که کمیته آمار جهاد سازندگی گزارش کرده است، تعداد کل گاومیش‌های ایران در سال 1388 حدود 475 هزار رأس برآورد شده است (منافی آذر، 1389). پتانسیل تولید حیوانات اهلی با اصلاح ژنتیکی و با استفاده از یکی از شیوه‌های مدرن اصلاح نژاد و برای مثال تلقیح می‌تواند افزایش یابد. البته کیفیت منی منجمد- یخ‌زدایی شده یکی از فاکتورهای مهم تاثیرگذار روی احتمال لقاح تخم است (Saacke, 1984). مشکلات مربوط به استحصال منی با کیفیت از گاومیش­های نر با امتیاز تولیدمثلی بالا به همراه چندین عامل دیگر، گسترش تلقیح مصنوعی را محدود می­کند. به خاطر قابلیت انجماد و باروری ناچیز اسپرماتوزوآی گاومیش وقتی که با اسپرماتوزوآی گاو مقایسه می‌شود، کاربرد تلقیح مصنوعی با منی منجمد- یخ‌گشایی شده در مقیاس محدودی گزارش شده است ­(Andrabi et al., 2008; Kumaresan et al., 2005; Senatore et al., 2004; Ahmad et al., 2003). اولین بچه گاومیشی که به صورت مصنوعی تلقیح شده بود، در انستیتو کشاورزی الله‌آباد در هند، در سال 1943 متولد شد. در پستانداران، پلاسمای منی حاوی یک تعداد ترکیبات آنتی‌اکسیدانی مانند سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و پاک کننده‌های رادیکال‌های آزاد شبیه ویتامین E، C، هیپوتائورین، تائورین و آلبومین می‌باشد (Lewis et al., 1997; Zini et al., 2002).

   این تحقیق به منظور بررسی اثرات سطوح مختلف آنتی‌اکسیدان‌های سیستئامین، ویتامین E روی  فراسنجه­های میکروسکوپی منی در گاومیش­های ایرانی موجود در ایستگاه تحقیقاتی پرورش و اصلاح نژاد گاومیش شمال غرب کشور (مرکز تحقیقاتی جبل) پس از رفع انجماد منی انجام پذیرفت.

 

مواد و روش­ها

   تحقیق حاضر در مرکز پرورش و اصلاح نژاد گاومیش شمال‌غرب کشور (ایستگاه جبل- ارومیه) واقع در استان آذربایجان‌غربی، شهرستان ارومیه با استفاده از چهار رأس گاومیش نر با میانگین سن (4/0±2/4) سال از اکوتیپ ‌بومی (آذربایجان) انجام پذیرفت. عمل جمع‌آوری منی با استفاده از مهبل مصنوعی مخصوص گاومیش (مدل گاومیش IMV فرانسه) هفته‌ای دو بار انجام گرفت. بلافاصله پس از جمع‌آوری، کیفیت منی در گسترش ضخیم از لحاظ تراکم و تحرک زیر میکروسکوپ صفحه گرم ارزیابی و ثبت گردید. پس از ارزیابی اولیه، نمونه‌های منی اخذ شده با مقادیر  75/0، 5/1، 2 و 5  میلی­مول ویتامین E و 5/7، 5/12، 15 و 20  میلی­مول سیستئامین در رقیق­کننده بایوکسل (BioXell, Cosmo Pharmaceuticals, Italy ) رقیق گردیده و بعد از طی یک ساعت سرد شدن، در دمای 37 درجه سلسیوس بن‌ماری و اعمال زمان تعادل به مدت چهار ساعت در دمای چهار درجه سلسیوس یخچال به طور اتوماتیک در پایوت‌های 5/0 میلی‌لیتری (با احتساب 10٦×20 اسپرماتوزویید در هر پایوت) بسته‌بندی و در ازت مایع منجمد شدند. پایوت‌های 5/0 میلی‌لیتری منی منجمد تهیه شده به تفکیک برای گروه‌های درمانی مورد آزمایش از ظرف ازت مایع نگه‌داری (196- درجه سلسیوس) بیرون آورده شد و  در حمام آب گرم در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 40 ثانیه، عمل یخ­زدایی روی آن‌ها انجام گرفت. برای هر نمونه مورد نظر حداقل پنج پایوت استفاده شده و درصد تحرک، درصد اسپرماتوزوییدهای با حرکت پیش‌رونده رو به جلو و شاخص‌هایی نظیرCurvilnear Velocity (VCL) ، Straight-line Velocity (VSL)، Average path Velocity (VAP)، Beat–Cross Frequency (BCF)، Amplitude of Lateral Head Displacement (ALH) ، Linearity (LIN) ، (STR)  Straightness و (WOB) Wobble  به تفکیک برای نمونه‌های منی رقیق شده مورد نظر به‌وسیله سیستم ارزیابی کامپیوتری الگوی تحرک اسپرم (CASA) Computer-Assisted Sperm Analysis مورد بررسی قرار گرفت. میزان سوپر اکسید ­دیسموتاز به روش سان و زیمن (1978) با اسپکتروفتومتر (560 نانومتر) سنجش شد (Sun and Zigman, 1978). داده‌های به‌دست آمده از این تحقیق با استفاده از نرم افزار آماری SPSS (نسخه 16) مدل خطی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و جهت مقایسه­ میانگین بین تیمارهای آزمایش و شاهد از آزمون دانکن استفاده شد. داده­ها در سطح احتمال 5 درصد (05/0>p) معنی‌دار تلقی شده و تمامی نتایج نیز به صورت میانگین ± انحراف استاندارد نشان داده شده است.

یافته­ها

   بر اساس جدول 1 افزودن ویتامین E با سطوح 5/1 و 2 میلی­مول موجب افزایش غیر معنی­دار میزان تحرک کلی اسپرماتوزوئیدها نسبت به گروه کنترل گردید (به‌ترتیب 79/9±44/38 و 53/5±46/26 در مقابل 06/4±51/17). درصد اسپرم­های دارای حرکت پیشرونده در تیمار حاوی 5/1 میلی­مول ویتامین E نسبت به تیمار کنترل بالاتر (به­ترتیب 56/11±76/ 34 در مقابل 90/3±25/13) بود  (05/0>p). درصد اسپرم‌های تیپ A در تیمار حاوی 5/1 میلی‌مول ویتامین E بیشترین و در تیمار حاوی 2 میلی­مول ویتامین E کمترین میزان بود (05/0>p).

تیمار حاوی 5/1 میلی­مول ویتامین E از نظر فاکتورهای  BCF, VSL, MAD  وVAP تفاوت معنی­دار با تیمار کنترل و دیگر تیمارهای ویتامین E داشت (05/0>p). بیشترین درصد LIN STR, و WOB متعلق به تیمار حاوی 5/1 میلی­مول ویتامین E  بود (05/0>p). اثرات افزودن ویتامین E به رقیق کننده بایوکسل در فعالیت آنتی اکسیدانی منی منجمد- یخ­زدایی شده گاومیش در نمودار 1 نشان داده شده است.  

   همان‌طور که مشاهده می­شود پایین­ترین سطح سوپراکسیددیسموتاز (SOD) متعلق به تیمار حاوی 5 میلی‌مول (15/0±9/0) و بیشترین سطحSOD  متعلق به تیمار حاوی 5/1 میلی‌مول ویتامین E (10/0±5/1) بود.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1- شاخص­های کمی نمونه­های منی منجمد-یخ­گشایی شده حاوی مقادیر متفاوت ویتامین E (میانگین±انحراف استاندارد)

فاکتور

گروه ویتامین E(میلی مول)

کنترل

75/0

5/1

2

5

درصد تحرک

ab06/4±51/17

ab09/1±71/15

a 79/9±4/38

ab 35/5±46/26

b 02/1±7/7

درصد اسپرم­ها با تحرک پیش‌رونده

b90/3±25/13

b 41/0±3/14

a 56/11±76/34

ab 87/4±65/23

b 15/1± 2/5

اسپرم‌های تیپ A

b97/1±75/3

ab 07/2±7/10

a 44/8±1/21

ab 82/4±52/9

b 16/1±81/1

اسپرم‌های تیپ B

ab 50/2±51/9

b 11/2±04/4

a 22/5± 5/13

a 86/0±13/14

b 11/1±71/3

اسپرم‌های تیپ C

39/1±25/4

19/1± 19/1

22/2± 67/3

75/0±81/2

23/1±44/2

اسپرم‌های تیپ D

ab 06/4±48/82

ab 09/1± 28/84

c 79/9±55/61

bc 53/5±54/73

a 02/1±2/92

VCL (μm/s)

ab 16/1±98/17

ab 45/1± 8/14

a 74/5± 2/27

ab 44/1±48/18

ab 50/0±9/13

VSL (μm/s)

b 25/1±58/4

b 06/0± 5/5

a 35/0± 42/14

b 15/1±99/5

b 15/1±31/2

VAP (μm/s)

b3/1±58/7

a 33/0±21/7

b74/4± 26/17

b 17/1±4/8

b 40/0±5/4

MAD

b 24/0±37/22

b 87/6±8/13

a 02/3±6/27

b 66/2±30/22

b 12/1±8/15

ALH

ab 03/0±09/1

c 09/0±81/0

a 08/0±26/1

bc 07/0±02/1

bc 03/0±9/0

BCF

b 08/0±69/1

b 16/0±46/1

a 06/0±25/3

b 51/0±13/2

b 24/0±43/1

LIN

bc 88/1±60/17

bc 61/1±09/22

a 31/7±07/37

ab 44/4±38/25

c 33/1±07/11

WOB

b 79/1±86/35

b 44/4±43/40

a 07/4±92/52

b 79/1±86/35

b 67/1±04/30

STR

b 33/1±32/45

b 90/3±22/46

a 83/9±53/63

ab 49/2±06/51

b 57/2±31/35

:a-c           در هر ردیف اعدادی که دارای حروف مشابه نیستند، اختلاف معنی‌داری دارند (05/0>p)

 

 

نمودار 1- اثر سطوح مختلف ویتامین E بر میزان سوپراکسیددیسموتاز (SOD) در تیمارهای آزمایشی و کنترل

 

 

   بر اساس جدول 2 افزودن سیستئامینبا سطح 20 میلی­مول بیشترین (55/13±16/38) و سطح 5/7 میلی‌مول سیستئامین به­همراه گروه کنترل کمترین (87/1±05/7) میزان تحرک کلی اسپرماتوزوئیدها را سبب گردید (05/0>p). بیشترین و کمترین درصد اسپرم­های دارای حرکت پیشرونده  به­ترتیب در تیمار حاوی 20 و 5/7 میلی­مول سیستئامین به­همراه گروه کنترلبود (05/0>p). درصد اسپرم­های تیپ A در تیمار حاوی 20 میلی­مول سیستئامینبیشترین و در تیمار حاوی 5/7 میلی­مول سیستئامینکمترین میزان بود (05/0>p).

   تیمار کنترل و تیمار حاوی 5/7 میلی‌مول سیستئامیناز نظر فاکتور VSL، VSL،BCF ، MAD و VAP تفاوت معنی­دار با تیمار حاوی 20 میلی­مول سیستئامینداشت (05/0>p). بیشترین درصد LIN و WOB متعلق به تیمار حاوی 20 میلی‌مول سیستئامینبود (05/0>p). کمترین درصد ALH متعلق به تیمار حاوی 5/7 میلی‌مول سیستئامینبود. اثرات افزودن سیستئامین به رقیق کننده در فعالیت آنتی اکسیدانی منی منجمد- یخ‌زدایی شده گاومیش در نمودارهای (2) نشان داده شده است. تفاوت معنی­دار سطحSOD  در تیمارهای حاوی 5/12، 15 و20  میلی­مول سیستئامین نسبت به تیمار کنترل مشاهده شد (05/0>p).

 

 

جدول 2- شاخص­های کمی نمونه­های منی منجمد-یخ­گشایی شده حاوی مقادیر متفاوت سیستئامین (میانگین± انحراف استاندارد)

فاکتور

گروه سیستئامین(میلی‌مول)

کنترل

5/7

5/12

15

20

درصد تحرک

ab06/4±51/17

b 87/1±05/7

ab 26/9±54/25

ab 87/1±21/25

a 55/13±16/38

درصد اسپرم­ها با تحرک پیش رونده

b90/3±25/13

b 99/2±67/4

ab 29/7±41/23

ab 82/3±14/21

a 25/21±70/31

اسپرم‌های تیپ A

b97/1±75/3

b 11/0±85/0

ab 16/2±78/11

ab 00/4±92/11

a 89/6±36/16

اسپرم‌های تیپ B

ab 50/2±51/9

22/2± 75/3

13/5± 63/11

13/2± 23/9

45/5±31/15

اسپرم‌های تیپ C

39/1±25/4

72/1± 57/3

01/2± 13/3

45/2± 06/4

81/1±45/6

اسپرم‌های تیپ D

ab 06/4±48/82

a 93/1±01/93

ab 26/9±45/73

ab 10/5±78/74

b 55/13±83/61

VCL (μm/s)

ab 16/1±98/17

b 68/1±88/13

ab 56/3±15/19

ab 00/2±28/21

a 54/5±60/26

VSL (μm/s)

b 25/1±58/4

b 51/0±17/2

ab 01/2±19/7

ab 92/1±27/8

a 08/4±02/11

VAP (μm/s)

b3/1±58/7

b 08/0±62/4

ab 52/2±04/10

ab 80/1±26/11

a 69/4±73/14

MAD

b 24/0±37/22

b 19/4±75/17

ab 39/5±18/25

ab 40/2±37/26

a 19/7±61/34

ALH

ab 03/0±09/1

b 07/0±95/0

ab 13/0±07/1

ab 05/0±17/1

a 15/0±32/1

BCF

b 08/0±69/1

b 22/0±45/1

ab 32/0±58/2

ab 42/0±78/2

a 77/0±46/3

LIN

bc 88/1±60/17

a 92/5±49/14

a 94/3±08/26

ab 27/3±07/26

a 02/6±06/29

WOB

b 79/1±86/35

a 78/3±59/43

ab 77/4±74/33

ab 70/1±53/44

a 46/5±89/46

STR

b 33/1±32/45

a21/5±39/53

b87/7± 47/41

a20/3± 48/52

a95/4±11/55

:a-b            در هر ردیف اعدادی که دارای حروف مشابه نیستند، اختلاف معنی‌داری دارند (05/0>p)

 

 

 

 

 

 

نمودار 2- اثر سطوح مختلف سیستئامین بر میزان سوپراکسیددیسموتاز (SOD) در تیمارهای آزمایشی و کنترل

 


بحث و نتیجه­گیری

   به­نظر می‌رسد ویتامین E ترکیب اولیه سیستم آنتی‌اکسیدانی اسپرم بوده و نقش اصلی را در برابر حفاظت اسپرم از رادیکال­های آزاد و آنزیم­های تجزیه‌کننده لیپید غشاء اسپرم فراهم می­کند. در مطالعه بانسال و بیلاسپوری در سال 2009 سه سطح ویتامین E (1، 2 و 5/2 میلی‌مول) به اسپرم گاو نر اضافه شد و تمامی دزهای ویتامین E سبب افزایش تحرک اسپرم و افزایش ماندگاری آن شده و باعث کاهش لیپید پراکسیداز گردید و غلظت 2 میلی‌مول ویتامین  E بیشترین تاثیر را داشت (Bansal and Bilaspuri, 2009 ). در مطالعه ما نیز 4 سطح ویتامین E به اسپرم گاومیش اضافه شد و پس از انجماد در مقایسه با شاهد درصد تحرک و ماندگاری بیشتر بود و بیشترین تاثیر از نظر تحرک و شاخص­های کمی اسپرم در تحقیق حاضر، در تیمار 5/1 میلی‌مول مشاهده گردید که با نتیجه بنسال و بیلاسپوری همخوانی دارد. در بررسی موحدیان و همکاران در سال 1387 در مورد تاثیر ویتامین E بر کیفیت اسپرم منجمد و یخ­زدایی شده انسانی مشاهده شد که افزودن سطوح  1 و 2 میلی‌مولار ویتامین E سبب افزایش درصد تحرک، درصد حرکت پیش­رونده و افزایش درصد زنده‌مانی اسپرم شد (Movahedin et al., 2008). در مطالعه ما سطح 5 میلی­مول ویتامین E در رقیق کننده سبب افت شاخص­های کیفی نمونه­های منی مورد بررسی شد که این اختلاف می­تواند ناشی از تفاوت گونه­ مورد بررسی با مطالعات ذکر شده باشد. در مطالعه اندرابی و همکاران درسال 2008 در مورد تاثیر ویتامین E در رقیق کننده منی با پایه تریس در زمان‌های صفر و 6 ساعت پس از یخ‌زدایی و انکوباسیون منی گاومیش، درصد اسپرم­های با آکروزوم طبیعی پس از انجماد و یخ­زدایی در مقایسه با گروه شاهد بیش‌تر بود (Andrabi et al., 2008). در مطالعه برینگر و همکاران در سال 2005 رقیق‌کننده منی خوک حاوی ویتامین E در مقایسه با گروه شاهد سبب افزایش درصد تحرک، درصد زنده‌مانی و افزایش درصد تورم آکروزوم در محیط هایپواسموتیک شده و بهترین نتیجه در غلظت 2 میلی‌مول به دست آمد (Breinger et al., 2005). نتایج مطالعه برزینسکا و همکاران در سال 1995 نشان ­داد که آلفاتوکوفرول باعث تحرک و افزایش زنده‌مانی اسپرم خوک شد. علاوه بر این اثرات این ماده نسبت به غلظت آن متفاوت است به­طوری که غلظت‌های بالای آلفاتوکوفرول اثرات اکسیداتیو ولی غلظت‌های پائین آن اثرات آنتی­اکسیداتیو دارد (Brezeinska et al., 1995). نتایج تحقیق حاضر با نتیجه مطالعه برزینسکا و همکاران در سال 1995 در خصوص اثر سمی سطوح بالای ویتامین E همخوانی دارد.

   بر اساس گزارشات، افزودن اسیدهای آمینه انتخابی (گلوتامین، گلایسین، آلانین و سیستئن) به رقیق‌کننده (تریس، سیترات، فروکتوز و گلیسرول) منی گاومیش قبل از انجماد، باعث بهبود فراسنجه­های کیفیت منی گاومیش بعد از رفع انجماد شده است (El-Sheshtawy et al., 2008). ترکیبات تیولی با وزن ملکولی کم مانند سیستئامین و بتا-مرکاپتواتانول سبب تحریک جذب سیستین توسط سلول­های پستانداران شده، منجر به افزایش تولید داخل سلولی گلوتاتیون می­شود. در مطالعه چیفچی و همکاران در سال 2009 ملاحظه شد، ان-استیل سیستئین (NAC) اثر مثبتی بر پارامترهای منی مانند حجم، تحرک و ویسکوزیته داشت (Ciftci et al., 2009). همچنین NAC سبب کاهش انواع اکسیژن واکنش­پذیر (ROS) در پلاسما و کاهش ویسکوزیته منی شد (Ciftci et al., 2009). ادا و همکاران در سال 1997 اسپرم انسان را با NAC در دمای اتاق مجاور نموده و ملاحظه کردند که این عمل سبب بهبود تحرک و کاهش ROS منی گردید (Oeda et al., 1997). افزودن سیستئامین، تائورین، تره­هالوز و هیالورونان به رقیق کننده قبل از انجماد، باعث افزایش تحرک و ظرفیت آنتی­اکسیدانی اسپرم گوسفند شد (Bucak et al., 2007).افزودن آنتی‌اکسیدان­هایی از قبیل تائورین، هیپوتائورین، گلوتانین، گلوتانین اکسیده، سیستئین، آلبومین سرم گاوی، تره­هالوز و هیالورونان به رقیق کننده قبل از انجماد باعث تاثیر مثبت بر درصد تحرک اسپرم، مورفولوژی اسپرم، درصد قابلیت زنده­مانی اسپرم و محافظت فراسنجه­های منی پس از رفع انجماد می‌گردد (Uysal et al., 2007).

   این مطالعه نشان داد که الحاق ترکیباتی مانند ویتامین E و سیستئامین با سطوح مناسب به رقیق کننده قبل از فرآیند انجماد منی گاومیش، تاثیر مناسبی در بهبود شاخص‌های ارزیابی منی منجمد نظیر میزان درصد تحرک و برخی فراسنجه‌‌های کیفی اسپرماتوزوییدها دارد.

  • منافی آذر، ق.، محسن پور آذری، ع. و رزاق زاده، س. (1389). بررسی وضعیت بهداشت و تولید مثل گاومیش در شرایط بومی استان آذربایجان غربی. مجموعه گزارش­های علمی، مرکز پژوهش­ها منابع طبیعی و امور دام استان  آذربایجان­غربی، قابل دسترسی در تارنمای: http://www.jkmt.ir/article/m2/455.pdf.
    • Ahmad, Z., Anzar, M., Shahab, M., Ahmad, N. and Andrabi, S.M.H. (2003). Sephadex and sephadex ion-exchange filtration improves the quality and freezability of low-grade buffalo semen ejaculates. Theriogenology, 59: 1189-1202.
    • Andrabi, S.M.H., Ansari, M.S., Ullah, N. and Afzal, M. (2008). Effect of non-enzymatic antioxidants in extender on post-thaw quality of buffalo (bubalus bubalis) bull spermatozoa. Pakistan Veterinary Journal, 28(4): 159-162.
    • Bansal, A.K. and Bilaspuri, G.S. (2009). Antioxidant effect of vitamin E on motility, viability and lipid peroxidation of cattle spermatozoa under oxidative stress. Animal Science Papers and Reports, 27(1): 5-14.
    • Breinger, E., Beorlegui, N., Flaherty, C. and Beconi, M. (2005). Alpha-tocopherol improves biochemical and dynamic parameters in cryopreserved boar. Theriogenology, 63: 2126-2135.
    • Brezezinska, E., Slebodzinski, A., Pietras, B. and Wieczork, G. (1995). Antioxidant effect of vitamin E and glutathione on lipid peroxidation in boar seminal plasma. Biological Trace Element Research, 47: 69-74.
    • Bucak, M.N., Atessahin, A., Varıslı, O., Yuce, A., Tekin, N. and Akcay, A. (2007). The influence of trehalose, taurine, cysteamine and hyaluronan on ram semen: Microscopic and oxidative stress parameters after the freeze–thawing process. Theriogenology, 67(5): 1060-1067.
    • Ciftci, H., Verit, A., Savas, M., Yeni, E. and Erel, O. (2009). Effects of N-acetylcysteine on semen parameters and oxidative/antioxidant status. Urology, 74(1): 73-76.
    • Dehghani Ghale-jughi, H. (1991). Study of reproductive glands in non-castrated male buffaloes in west Azerbaijan. DVM thesis, Urmia University, Thesis No. 245.
    • El-Sheshtawy, R.I., El-Sisy, G.A. and El-Nattat, W.S. (2008). Use of selected amino acid to improve buffalo bull semen cryopreservation. Global Veterinaria, 2(4): 146-150.    
    • Food and Agricultural Organization. (2004). FAOSTAT, global livestock production and health atlas. Animal production and health division, Rome, Italy. www.fao.org/ag/aga/glipha/index.jsp.
    • Kumaresan, A., Ansari, M.R. and Abhishek, G. (2005). Modulation of post-thaw sperm functions with oviductal proteins in buffaloes. Animal Reproduction Science, 90: 73-84.
    • Lewis, S.E.M., Boyle, P.M., Mckinney, K.A., Young I.S. and Thompson, W. (1997). Comparison of individual antioxidants of sperm and seminal plasma in fertile and infertile men. Fertility and Sterility, 67: 142-147.
    • Movahedin, M., Bejnurdi, M., Amanpour, S. and Hamid Abadi, H. (2008). Effect of antioxidant on quality of frozen–thawed sperm by vitrification method, Journal of Mazandaran University of Medical Sciences, 63: 27-20.
    • Oeda, T., Henkel, R., Ohmori, H. and Schill, W.B. (1997). Scavenging effect of N-acetyl-l-cysteine against reactive oxygen species in human semen: a possible therapeutic modality for male factor infertility. Andrologia, 29: 125-131.
    • Saacke, R.G. (1984). Semen quality: importance of and influencing factors (abstract). Paper. Presented in NAAB 10th Technical Conference on Artificial Insemination and Reproduction, pp: 30-36.
    • Senatore, E.M., Verberckmoes, S., Pascale, M. and Presicce, GA. (2004). A deep utero-tubal semen deposition in Mediterranean Italian buffaloes using a new artificial insemination device. Reproduction, Fertility and Development, 16: 133.
    • Sun, M. and Zigman, S. (1978). Determination of superoxide dismutase in erythrocytes using the method of adrenaline auto oxidation.  Analytical Biochemistry, 90: 81-89.
    • Uysal, O., Bucak, M.N., Yavas, I. and Varıslı, O. (2007). Effect of various antioxidants on the quality of frozen–thawed bull semen. Journal of Animal and Veterinary Advances, 6(2): 1362-1366.
    • Zini, A.M., Fischer, A., Mak, V., Phang, D. and Jarvi, K. (2002). Catalase-like and superoxide dismutase-like activities in human seminal plasma. Urological Research, 30: 321-323.