نوع مقاله: علمی پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شبستر، استادیار گروه دامپزشکی، شبستر، ایران.
2 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، استادیار گروه پاتوبیولوژی، تبریز، ایران.
3 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شبستر، کارشناس ارشد گروه دامپزشکی، شبستر، ایران.
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
In order to increase information about the molecular diversity of Pasteurella multocida isolated from cattle and buffalo, 2 buffalo and 8 cattle isolates were investigated by Restriction Endonuclease Analysis (REA). REA was performed with Hha-I Endonuclease which established 2 distinct profiles: I and II. Cattle and buffalo isolates fell into both REA profiles. Contrary to previous studies, the genetic diversity of the isolates was negligible. Considering the similarity of cattle and buffalo isolates is the present study, further studies witch larger samples should be carried out to investigate the possibility of inter-species transmission.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
پاستورلا مولتوسیدا یکی از عوامل باکتریائی بسیار مهم در بیماری‌های گاو و گاومیش بوده و علاوه بر آن در گوسفند، خوک و طیور نیز ایجاد بیماری می‌کند. این باکتری در گاو عامل سپتی سمی هموراژیک (Hemorrhagic septicemia) و یکی از عوامل دخیل در تب حمل و نقل و پاستورلوز ریوی گاوی (Bovine pneumonic pasteurellosis) می‌باشد. در گوسفند نیز پاستورلا مولتوسیدا از عوامل دخیل در پاستورلوز ریوی محسوب میشود. این بیماری یکی از مشکلات جدی در طب گاو و گوسفند بوده و امروزه تلاش‌های بسیاری در جهت مبارزه و پیشگیری از این بیماری در حال انجام می‌باشد (Quine et al., 2002).
مطالعه و تعیین تیپ در پاستورلا مولتوسیدا به هر دو روش فنوتیپی و ژنوتیپی مورد ارزیابی قرار گرفته و سیستم‌های متعددی برای آن مطرح است. اما روشهای مطالعه فنوتیپی پاستورلامولتوسیدا با ایراداتی روبرو می‌باشند (Towensend et al., 2001). بنابراین، در سال‌های اخیر استفاده از روشهای شناسائی و دسته‌بندی با روشهای مولکولی رایج گردیده و تلاش‌های بسیاری در جهت تقسیم‌بندی باکتری بر پایه خصوصیات ژنتیکی در حال انجام است. از روشهای مهم تعیین ژنوتیپی می‌توان به روش برش با آنزیم‌های تعیین حدودی (Restrictions endonuelease analysis, REA)، Ribotyping، Pulsed field gel electrophoresis ، Multilocus enzyme electrophoresis و نیز REP-PCR (Repetitive- extragenic plaindormic PCR) اشاره کرد. در میان این روشها روش REA به تنهائی یا در کنار روش Ribotyping جهت تعیین قرابت اپیدمیولوژیک بین جدایههای مختلف شده و میزان صحت حساسیت و اختصاصیت این روش بسیار بالا ارزیابی گردیده است (Blackall and Miffin, 2000).
تاکنون استفاده از روش فوق در مطالعات اپیدمیولوژیک جدایههای پاستورلا مولتوسیدا از طیور، گاو، خوک وگوزن نتایج مطلوبی را در پی داشته است (Davise et al., 2004; Weiser et al., 2003) تاکنون دو مطالعه با این روش در ایران روی جدایههای پاستورلا مولتوسیدا در طیور و نیز بز و گوسفند انجام شده است (Jabbari et al., 2002; Shayegh et al., 2011).
مواد و روشها
تهیه جدایه‌ها: در مطالعه حاضر تعداد 10 جدایه حاصل از پنومونی گاو که در آزمایشگاه میکربیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شبستر قبلاً مورد مطالعات بیوشیمیائی قرار گرفته و به روش مولتی پلکس PCR تایید و نیز از نظر کپسولی تعیین تیپ شده بود (Shayeh et al., 2010a)، تهیه شد (جدول 1).
استخراج:DNA روش استخراج DNA برای همه جدایه‌ها با استفاده از پروتکل بلاکال و همکاران، با اصلاحاتی به شرح ذیل انجام گردید (Blackall et al., 1995). ابتدا 2 تا 3 پرگنه پاستورلا مولتوسیدا در محیط BHI broth (مرک) ، داخل لوله‌های درپیچ دار به ابعاد 12×16 کشت داده شده و در دمای 37 درجه سلسیوس با حرکت ملایم به‌مدت 24ساعت انکوبه شدند. لوله حاوی باکتری درrpm 6000 به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ گردیدند. مایع رویی بیرون ریخته شد و یک میلی‌لیتر از بافر فسفاته نمکی (PBS) به پلیت حاصله افزوده گردید. در مرحله بعد محتوای لوله به یک میکروتیوب 5/1 میکرولیتری تمیز ریخته شده، مجدداً در g1000 به‌مدت 10 دقیقه به‌منظور شستشو سانتریفیوژ انجام گرفت. این عمل 3 بار تکرار شد. سپس مقدار یک میلی‌لیتر از بافر سالین 85/0 درصد وEDTA 05/0 مولار به آن افزوده و به‌شدت ورتکس شد. در مرحله بعد مقدارl µ1000 از محلول لیزوزیم (فرمنتاز) با غلظتی برابرmg/ml 20 به میکروتیوب فوق افزوده گردیده و در داخل بن ماری با دمای 37 درجه سلسیوس به‌مدت 60 دقیقه انکوبه و سپس به آرامی مخلوط گردید. مقدارl µ100 از محلول SDS25 درصد به میکروتیوب فوق افزوده و دوباره به آرامی مخلوط شد. در مرحله بعد مقدارl µ10 از محلول پروتئیناز k با غلظتی برابر mg/ml 4/21 به میکروتیوب فوق افزوده شده و در داخل یخ به مدت 15دقیقه انکوبه و سپس به آرامی مخلوط گردید. میکروتیوب فوق در داخل بن‌ماری با دمای 65 درجه سلسیوس به‌مدت 25 دقیقه انکوبه و مقدارl µ 5/10 ازمحلول RNase با غلظتی برابر mg/ml 10به میکروتیوب فوق افزوده و در داخل بن‌ماری با دمای 37 درجه سلسیوس به‌مدت 30 دقیقه انکوبه و سپس به آرامی سر و ته گردید. در مرحله بعدی مقدارl µ 800 از محلول کلروفرم-فنل (1 به 1) به عصاره فوق افزوده شده و با احتیاط و به آرامی مخلوط گردید. پس از آن میکروتیوب فوق در rpm 14000 به‌مدت 5 دقیقه در 4 درجه سلسیوس سانتریفیوژ شد. فاز رویی داخل میکروتیوب به یک میکروتیوب 5/1 میلی‌لیتری جدید و تمیز انتقال داده شد. مقدار 25/0 حجم کلی از محلول استات سدیم 3 مولار به محتوای میکروتیوب فوق افزوده و به آرامی مخلوط شد. مقدار 5/2 برابر حجم کلی از اتانول مطلق با دمای 20- درجه سلسیوس به محتوای میکروتیوب فوق افزوده و به آرامی مخلوط گردیده و در فریزر 20- درجه سلسیوس به‌مدت 30 دقیقه انکوبه گردید. پس از انکوباسیون، میکروتیوب‌ها در دور rpm 14000 به‌مدت 5 دقیقه در 4+ درجه سانتریفیوژ گردیدند. اتانول با وارونه قرار دادن میکروتیوب حاوی DNA استخراج شده، خارج و تا خشک شدن کامل در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه شد. پس از آن مقدار µl 100 آب دیونیزه به آن اضافه و به آرامی با سمپلر مخلوط شد. پس از استخراج بلافاصله غلظت DNA استخراج شده با اسپکتروفتومتر در طول موج‌های 280 و 260 نانومتر محاسبه گردید.
اجرای روش REA با استفاده از آنزیم HhaI: پس از تنظیم غلظت DNA استخراج شده به میزان 5 میکروگرم روش REA پیشنهاد شده توسط Sambrook (1995)، به‌مدت 3 ساعت مورد هضم آنزیمی با آنزیم HhaI قرار داده و پس از خنثی‌سازی آنزیم طبق بروشور کارخانه سازنده مقدار 20میکرولیتر از DNA هضم شده با 4 میکرولیتر از 6xLoading Dye solution مخلوط و به‌صورت افقی در ژلی از آگارز با غلظت 7/0 درصد در 25 ولت و به‌مدت 16 ساعت الکتروفورز گردید. ژل حاصله به‌مدت 30 دقیقه در اتیدیوم بروماید، رنگ‌آمیزی و سپس با استفاده از دستگاه UV Thech عکسبرداری گردید.
یافتهها
روشREA با استفاده از آنزیم HhaI: نتایج حاصل از استخراج DNA پس از ارزیابی با روش اسپکتروفتومتر و الکتروفورز نشان از استخراج با نتایج مطلوب و غلظت مناسب داشت. نتایج حاصل از اجرای روش تعیین تیپ REA پس از استخراج DNA رضایت‌بخش بوده و الگوهای حاصل از هضم آنزیمی در شکل 1 ارائه شدهاند. بررسی الگوهای حاصله از REA وجود 2 الگو (I و II) را نشان می‌دهد. هر دو الگوی حاصله بین جدایههای بهدست آمده از گاو و گاومیش مشترک بودند (جدول 1).
شکل1-M : نشانگر فاژی لامبدا، I: الگوی شماره I ،II: الگوی شماره II
جدول 1- نمونه‌های مورد استفاده و نتایج حاصله
|
شماره جدایه |
میزبان جدا شده |
ژنوتیپ کپسولی |
الگوی REA |
|
1 |
گاو |
A |
I |
|
2 |
گاومیش |
D |
I |
|
3 |
گاو |
B |
I |
|
4 |
گاو |
A |
II |
|
5 |
گاو |
A |
II |
|
6 |
گاومیش |
A |
II |
|
7 |
گاو |
A |
II |
|
8 |
گاو |
B |
II |
|
9 |
گاو |
B |
II |
|
10 |
گاو |
B |
II |
بحث و نتیجهگیری
مطالعه حاضر، اولین مطالعه ژنوتیپی درخصوص جدایههای پاستورلا مولتوسیدای گاوی و گاومیشی در ایران با روش برش با آنزیم‌های تعیین حدودی است. نتایج تنها دو نوع الگوهای حاصله از روش مذکور را نشان می‌دهد. این نتایج در مقایسه با نتایج مطالعات مشابه در ایران (Jabbari et al., 2002; Shayegh et al., 2011) بیان می‌دارد که جدایههای گاوی و گاومیشی برخلاف جدایههای گوسفندی و بزی و همچنین جدایههای طیور دارای تنوع ژنتیکی کمتری می‌باشند و در تیپبندی به این روش به الگوهای کمتری تعلق می‌گیرند.
شایق و همکاران (2011) در مطالعه جدایههای بزی و گوسفندی توانسته‌اند آنها را به ترتیب در 5 و 6 گروه تقسیم‌بندی نمایند (Shayegh et al., 2011). مطالعه جباری و همکاران (2002) نیز تنوع بیشتری را در میان جدایههای طیور در کشور نشان می‌دهد (Jabbari et al., 2002).
نتایج این مطالعه با یافته‌های دیویس در سال 2004روی جدایههای گاوی مغایرت دارد. در مطالعه دیویس (2004) این تنوع بیشتر گزارش شده است و شاید این امر به‌دلیل محدود بودن نمونه‌های گاوی و گاومیشی در مطالعه حاضر باشد (Davise et al., 2004).
مطالعه توامان تعلق تیپ‌های کپسولی مختلف به الگوهای مشخص روش برش با آنزیم‌های تعیین حدودی در مطالعه حاضر رابطه خاصی را بین این دو دسته نشان نمی‌دهد. در مطالعات مشابه نیز چنین ارتباطی ملاحظه نگردیده بود. بنابراین نتایج حاصل از این مطالعه نتایج مطالعات قبلی را تصدیق می‌کند (Jabbari et al., 2002; Shayegh et al., 2011).
ارتباط میان جدایههای گاوی با گاومیشی که تنها در دو الگو دیده می‌شوند و شاید احتمال تبادلات جدایه‌ائی میان این دو گونه میزبانی را مطرح سازد. هر چند تعداد بیشتری جدایه از هر دو میزبان برای چنین ادعایی لازم است. برخی از مطالعات امکان چنین رویدادی را در میان دو میزبان گوسفند و بز در حیات وحش (Wesseir et al., 2002; Rudolph et al., 2003) و در گله‌های مخلوط گوسفند و بز در روش سنتی نگه‌داری ایشان در برخی کشورها از جمله ایران (Shayeh, et al., 2010b; Shayegh et al., 2011) محتمل دانسته‌اند. احتمال وجود چنین ارتباطی در میان گاو و گامیش نیز با توجه به سیستم پرورشی سنتی این دو حیوان در ایران نیز دور از ذهن نیست.
با توجه به نتایج بهدست آمده احتمال تبادل جدایههای گاوی و گاومیشی مطرح میگردد. پیشنهاد میشود این فرضیه با تعداد جدایههای بیشتر پاستورلا مولتوسیدا و نیز روشهای دیگر همچون بررسی تشابه توالی sRNA 16 تکرار گردد.
)