مطالعه اثرات پیشگیرانه نارینژنین از آسیب ایسکمی-خون‌رسانی مجدد روده کوچک در موش صحرایی

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسنده

استادیار گروه علوم درمانگاهی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.

چکیده

   مخاط روده به شدت توسط ایسکمی-خون­رسانی مجدد (IR) تحت تاثیر قرار می­گیرد. نشان داده شده است که نارینژنین در برابر آسیب ایسکمی-خون­رسانی مجدد در ارگان­های مختلف دارای اثرات محافظتی می­باشد. هدف از این مطالعه این است که آیا نارینژنین در آسیب ایسکمی-خون­رسانی مجدد روده موش صحرایی نقش محافظتی دارد. بدین منظور، 40 سر موش صحرایی نر ویستار به­طور تصادفی به چهار گروه شاهد (گروه 1)، شاهد جراحی (گروه 2)، ایسکمی-خون­رسانی مجدد (گروه 3) و ایسکمی-خون­رسانی مجدد به­علاوه تیمار با نارینژنین (گروه 4) تقسیم شدند. آسیب ایسکمی-خون­رسانی مجدد با 30 دقیقه ایسکمی روده و 60 دقیقه خون­رسانی مجدد ایجاد شد. موش­های گروه 4 نارینژنین (mg/kg 20) را 120 دقیقه قبل از القاء ایسکمی از طریق تزریق داخل صفاقی دریافت کردند. پس از انجام آزمایشات، ژوژنوم خارج و جهت آسیب­شناسی بافتی آماده گردید. فعالیت تام آنتی­اکسیدانی سرم و مقادیر مالون­دی­آلدئید، سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز در بافت ژوژنوم اندازه­گیری شد. آسیب‌شناسی بافتی، ارتشاح شدید سلول­های آماسی، کوتاه و کُند­شدگی پرزها، خونریزی لامینا پروپریا و نکروز سلول­های بافت پوششی ژوژنوم را در گروه ایسکمی-خون­رسانی مجدد نشان داد. مصرف نارینژنین آسیب ژوژنوم را موش­های گروه 4 کاهش داد. فعالیت تام آنتی­اکسیدانی سرم و مقادیر سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز در گروه ایسکمی-خون­رسانی مجدد کاهش یافت ولی به­طور معنی­داری (05/0>p) در گروه ایسکمی-خون­رسانی مجدد به­علاوه تیمار با نارینژنین افزایش یافت. نارینژنین مقدار مالون­دی­آلدئید را که در اثر ایسکمی-خون­رسانی مجدد افزایش یافته بود به­طور معنی­داری (05/0>p) کاهش داد. نتایج ما نشان داد نارینژنین روده باریک موش­های صحرایی را از آسیب ایسکمی-خون­رسانی مجدد محافظت کرد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Preventive effects of Naringenin (Citrus flavonone) on intestinal ischemia–reperfusion injury in the rat

نویسنده [English]

  • ghafour mousavi
چکیده [English]

The intestinal mucosa is known to be adversely affected by ischemia-reperfusion (I/R). It has been demonstrated that Naringenin has protective effects against ischemia-reperfusion injury in various organs. The aim of this study is to determine whether Naringenin has any protective role in I/R injury of the intestine in rats. For this purpose, forty male Wistar rats were randomly divided into four groups as control (group 1), sham IR (group 2), intestinal IR group (group 3) and Naringenin plus intestinal IR (group 4). Intestinal IR was produced by 30 minutes of intestinal ischemia followed by a 60 minutes of reperfusion. Rats in group 4 received Naringenin (20 mg/kg) intraperitoneally, 120 minutes before ischemia. After the experiments, the jejunum was removed and the tissues were processed for histopathological examination. Serum total antioxidant activity (TAA), and levels of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) were measured in jejunal tissue. Histopathologically, jejunal tissues of the intestinal IR group showed severe inflammatory cell infiltration, villus shortening and blunting and hemorrhage in lamina propria, as well as epithelial cell necrosis. Administration of Naringenin alleviated the jejunal damage in group 4. Levels of TAA, SOD, CAT, GPx and GR decreased in the intestinal IR group, but increased significantly (p<0.05) in the IR+Naringenin group. Naringenin significantly (p<0.05) decreased MDA levels which was increased by IR. Our results showed that Naringenin treatment protected the rat's intestinal tissue against intestinal ischemia-reperfusion injury.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Intestine
  • Ischemia–reperfusion
  • Naringenin (Citrus flavonone)
  • Rat

مقدمه

   آسیب ایسکمی-بازخون­رسانی روده در بیماران تحت اعمال جراحی و آسیب تروماتیک با مرگ­ومیر بالایی همراه است (Koike et al., 1993). این آسیب در شرایطی نظیر جراحی آنوریسم آئورت، بای­پس قلبی-ریوی، فتق­های اختناقی، آنتروکولیت نکروزان نوزادان و پیوند روده از اهمیت ویژ­ه­ای برخوردار است (Collard and Gelman, 2001). آسیب ایسکمی-بازخون­رسانی روده در شوک­های­سپتیک و هیپوولومیک نیز اتفاق می‌افتد (Moore et al., 1994; Swank and Deitch, 1996).

   مخاط روده به افت فشار خون احشایی، که وقوع آن پس از اعمال بزرگ جراحی ­عروق، بای پس قلبی ریوی، تروما، سوختگی، شوک هموراژیک، پانکراتیت حاد، بیماری­های ایسکمیک روده، انسداد عروق مزانتر و پیوند عضو، به‌ویژه پیوند روده کوچک اجتناب­ناپذیر است، بسیار حساس می­باشد (Collard and Gelman, 2001; Asfar et al., 1994; Cicales et al., 2001).

   برقراری مجدد جریان خون (بازخونرسانی) پس از یک دوره خون­رسانی ناقص و یا ایسکمی، طیفی از تغییرات را در میکروسیرکولاسیون روده آغاز می­کند که در نهایت باعث ایجاد آسیب در یکپارچگی پوشش مخاطی روده می­شود که تحت عنوان  آسیب ایسکمی/ خون­رسانی مجدد (Ischemia–Reperfusion (I/R) injury) روده شناخته می­شود. اختلال در عملکرد مخاط روده به دلیل آسیب ایسکمی/ خون­رسانی مجدد منجر به نفوذپذیری مخاط و عروق آن می­شود که باعث انتقال باکتری­ها شده  و در نهایت باعث التهاب سیستمیک، نارسایی تنفسی و ناتوانی اندام­های متعدد می­شود (Ozkan et al., 2009). مکانیسم­های درگیر در آسیب ایسکمی/ خون­رسانی مجدد چند عاملی بوده و به ­طور گسترده مورد بررسی و مطالعه قرار گرفته­اند (Mallick et al., 2004). یکی از این مکانیسم­ها تولید رادیکال­های آزاد اکسیژن مانند آنیون سوپراکسید، پراکسید هیدروژن (H2O2) و سایتوکاین­های التهابی است که از مکانیسم­های دفاعی طبیعی در مخاط پیشی گرفته و به آسیب سلولی منجر می­گردند (Yamamoto et al., 2001).

   برای محافظت در برابر آسیب ناشی از رادیکال­های آزاد، سلول­ها با مکانیسم­های تدافعی، که شامل آنزیم‌هایی با فعالیت آنتی­اکسیدانی هستند، مجهز شده‌اند. آنزیم­های آنتی­اکسیدان مانند سوپراکسید دیسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز به عنوان اولین خط دفاعی شناخته شده و ماکرومولکول­های بیولوژیک مانند DNA، پروتئین­ها و چربی­ها را در برابر آسیب رادیکال‌های آزاد محافظت می­کنند. سوپراکسید دیسموتاز به سرعت، یون سوپراکسید را به پراکسید هیدروژن کم خطر تبدیل می­کند که بعداً توسط کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز به آب تجزیه می­شود. بنابراین، سطوح بالای آنزیم­های آنتی­اکسیدان ممکن است ماکرومولکول­های سلولی را که به آسیب ناشی از استرس اکسیداتیو حساس هستند، محافظت کند (Mallick et al., 2004).

   در کل، شرایط پاتولوژیک نظیر سرطان­ها، پیری، بیماری­های قلبی-عروقی، ایسکمی و آماس در تولید و تجمع گونه‌های فعال اکسیژن دخیل هستند. بنابراین، از بین بردن گونه­های رادیکال اکسیژن یک راهکار تدافعی موثری در برابر بیماری­های مختلف قلمداد می­شود. آنتی‌اکسیدان‌ها موادی هستند که در صورت وجود در غذا‌ها و بدن، حتی در مقادیر ناچیز، می‌توانند بدن را در مقابل انواع مختلف آسیب‌های اکسیداتیو ناشی از گونه‌های فعال اکسیژن محافظت کنند. با انجام این مطالعه خاصیت دارویی نارینژنین در محافظت از بافت روده در شرایط ایسکمی- خون­رسانی مجدد مورد ارزیابی قرار می‌گیرد که در صورت تائید می‌تواند به عنوان یک منبع قابل دسترس با خاصیت آنتی‌اکسیدانی مورد استفاده قرار گیرد.

   فلاوونوئیدها ترکیبات پلی­فنلی با خصوصیات فارماکولوژیک متعدد هستند و به عنوان زداینده رادیکال­های آزاد با گروه هیدروکسیل در ساختار مولکولیشان عمل می­کنند (Arul and Subramanian, 2013). بر اساس تفاوت در ساختار مولکولی این ترکیبات، شش گروه عمده از فلاوونوئیدها وجود دارد که شامل: فلاوونول­ها (flavonols)، فلاوون­ها (flavones)، فلاوانون­ها (flavanones)، کاتچین­ها (catechins)، آنتوسیانیدین­ها (anthocyanidins) و ایزوفلاوون­ها (isoflavones) هستند (Kinoshita et al., 2006). نارینژنین (Naringenin)، 7،5،4-تری­هیدروکسی-تری­هیدروکسی ­فلاوانون (4,5,7-trihydroxyflavanone) فلاوانونی هست که به وفور در میوه خانواده مرکبات مثل پرتغال و نارنگی، گریپ فروت و همچنین گوجه فرنگی و گیلاس و کاکائو وجود دارد (Jain et al., 2011; Kawaii et al., 1999). به­طور طبیعی، این فلاوانون به شکل گلیکوزید (glycoside) درآمده و جذب روده­ای را افزایش می­دهد (Haidari etal., 2009).

   مطالعات نشان داده­است که نارینژنین دارای اثرات ضد­التهابی، آنتی­اکسیدانی، ضد­سرطانی و حفاظت از سیستم عصبی می­باشد (Choi and Ahn, 2008; Nalini et al., 2012; Lee and Kim, 2010; Miyake et al., 2003). نارینژنین ترکیبی با سه گروه هیدروکسیل بوده و بنابراین نسبت به سایر فلاوانون­ها توانایی و قدرت آنتی اکسیدانی بسیار بالایی داشته و قادر است آنزیم­های آنتی­اکسیدانی سلول­ها را تحریک کند  (Chiou and Xu, 2004; Pollard et al., 2006).  مطالعات فارماکولوژیک اثرات آنتی­دیابتیک (Ortiz-Andrade et al., 2008)، آنتی­آتروژنیک (Lisa et al., 1999)، ضدافسردگی (Zbarsky et al., 2005)، تعدیل­کنندگی سیستم ایمنی (Lisa et al., 1999)، ضد­سرطانی (Jong-Hwa etal., 2010)، محاظت­کنندگی از  DNA (Oršolić et al., 2011) و هیپولیپیدمیک (Mulvihill et al., 2009) ناینژنین را نشان داده­اند. نشان داده شده است که نارینژنین دارای اثرات بالقوه آنتی‌اکسیدانی (Rahigude et al., 2012) و ضد­التهابی (Hirai et al., 2007) برجسته­ای می­باشد. بنابراین، به نظر می­رسد که مصرف نارینژنین قبل از ایسکمی ممکن است بافت روده را در برابر آسیب ناشی از ایسکمی-خون­رسانی مجدد محافظت کند و مطالعه حاضر برای آزمون این فرضیه انجام شد.

 

مواد و روش‌ها

   این مطالعه از نوع تجربی آزمایشگاهی بوده و در سال 1393 در مرکز تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی تبریز انجام شد. در این مطالعه کلیه ملاحظات اخلاقی و پروتکل‌های کار بر روی حیوانات آزمایشگاهی مورد تائید کمیته نظارت بر حقوق حیوانات آزمایشگاهی، مد نظر قرار گرفت. برای انجام این مطالعه،  از 40 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار در محدوده وزنی 20±200 گرم استفاده شد. شرایط تغذیه و نگه­داری برای تمام گروه‌ها یکسان و به صورت 12 ساعت روشنایی/تاریکی و دمای 221 درجه سلسیوس بود. هر حیوان در یک قفس جداگانه نگه­داری شده و جیره غذایی یکسان و آب نیز به‌طور آزاد در دسترس قرار گرفت و پس از یک هفته عادت به شرایط جدید، آزمایش شروع شد. موش‌ها به‌طور تصادفی به 4 گروه مساوی شامل گروه شاهد، گروه شاهد جراحی،  گروه ایسکمی- خون­رسانی مجدد و گروه ایسکمی- خون­رسانی مجدد و تیمار با نارینژنین تقسیم شدند. در مورد موش­های گروه شاهد هیچگونه مداخله جراحی و دستکاری روده­ها انجام نشد. در گروه شاهد جراحی، موش­ها مشابه با گروه ایسکمی- خون­رسانی مجدد تحت عمل جراحی قرار گرفته ولی متحمل ایسکمی- خون­رسانی مجدد روده نشدند. این موش­ها به مدت برابر با گروه ایسکمی- خون­رسانی مجدد (30 دقیقه ایسکمی و 60 دقیقه خونرسانی مجدد) تحت بیهوشی قرار گرفته و قبل از القا ایسکمی حلال دی‌متیل‌سولفوکسید (DMSO) را از طریق تزریق داخل صفاقی دریافت کردند. موش­های گروه ایسکمی- خون­رسانی مجدد تحت عمل جراحی قرار گرفته و به مدت 30 دقیقه تحت ایسکمی، سپس 60 دقیقه دیگر تحت خون­رسانی مجدد روده قرار گرفتند. موش­های گروه ایسکمی- خون­رسانی مجدد به­علاوه تیمار با نارینژنین، نارینژنین (Sigma-Aldrich Chemical Co., United Kingdom) را به طور تازه با حل کردن پودر در حلال دی­متیل­سولفوکسید، به میزان mg/kg20 از راه تزریق داخل صفاقی، 120 دقیقه قبل از القا ایسکمی دریافت کردند. میزان و روش مصرف نارینژنین بر اساس مطالعات کارا و همکاران در سال 2014 انتخاب شده است (Kara et al., 2014).

   برای انجام جراحی موش­ها با تزریق داخل صفاقی کتامین هیدرو­کلراید (mg/kg 100) و زایلازین (mg/kg 20) بیهوش شدند. بعد از تراش موها و ضدعفونی پوست ناحیه شکم، برش خط وسط (midline incision) ایجاد شد. برای آشکارسازی آئورت بطنی، بخش­هایی از روده­ها  به خارج از حفره صفاق کنار زده شد. رطوبت و دمای روده­ها توسط پوشانیدن با گاز استریل خیس شده با نرمال سالین گرم، حفظ شد. در طول آزمایش دمای بدن موش­ها نیز با استفاده از یک لامپ گرم سربار در حدود 37 درجه سانتی­گراد تثبیت شد. برای ایجاد ایسکمی در روده­ها، آئورت شکمی در قسمت بالاتر از شریان سلیاک به مدت 30 دقیقه به‌وسیله گیره­­ غیر­تروماتیک عروقی مسدود شد. پس از برداشتن گیره­ها و رفع انسداد، خون­رسانی مجدد به مدت 60 دقیقه انجام شد. نمونه­برداری از خون و روده در تمامی گروه­ها 45 دقیقه بعد از خون­رسانی مجدد انجام شد.

   جهت ارزیابی و تعیین فعالیت آنتی­اکسیدانی تام سرم (Total Antioxidant Activity, TAA)  5 میلی­لیتر خون از آئورت شکمی موش­ها اخذ گردید. نمونه­های خون با سرعت 4000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. فعالیت تام آنتی­اکسیدانی پلاسما توسط تکنیک رنگ­سنجی (colorimetric technique) طبق روش میلر و همکاران در سال 1993 (Miller et al., 1993) با استفاده از کیت تجارتی (Randox Laboratories Ltd, UK) اندازه­گیری شد. در این روشABTS  (2,2′-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) با یک پراکسید (met-myoglobin) و H2O2 جهت تولید یک کاتیون رادیکال انکوبه می­شود (جذب در nm 734). این جذب با ظرفیت آنتی‌اکسیدانی ماده تست نسبت معکوس دارد. در نهایت، نتایج به صورت میکرومول در لیتر (µmol/l) ارائه شد.

   برای تعیین وضعیت آنتی­اکسیدانی روده، همه موش‌‌ها هم‌زمان به آسانی با تزریق دز بالای پنتوباربیتال سدیم (sodium pentobarbital) کشته شدند. حدود 5 سانتی‌متر از قسمت انتهایی ژژنوم سریعاً خارج و در سالین بسیار سرد شستشو و هموژنات 10%  در 15/1% (w/v) کلرور پتاسیم تهیه شد. هموژنات با سرعت 7000 دور در دقیقه و به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سلسیوس سانتریفیوژ شده و محلول رویی جهت سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدی از طریق اندازه‌گیری مقدار مالون‌دی‌آلدئید (MDA malondialdehyde;) و همچنین برای اندازه­گیری فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی سوپراکسید دیسموتازSOD)  superoxide dismutase;)، کاتالاز (‍‍CAT catalase;)، گلوتاتیون پراکسیداز (GPX glutathione peroxidase;) و گلوتاتیون ردوکتاز (GR glutathione reductase) مورد استفاده قرار گرفت.

   فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی مورد مطالعه و میزان MDA با استفاده از کیت­های تجاری موجود  (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) و طبق دستورالعمل شرکت تولید کننده کیت انجام شد. مقدار MDA بافتی به صورت نانومول مالون‌دی­آلدئید (nmol) در میلی­گرم پروتئین و فعالیت آنتی­اکسیدانی به صورت واحدهای قراردادی در میلی‌گرم پروتئین عنوان گردید.

   پراکسیداسیون چربی در بافت روده با روش رنگ‌سنجی (colorimetrically) به وسیله اندازه­گیری TBARS (thiobarbituric acid reacting substances) طبق روش فراگا و همکاران در سال 1988 انجام شد (Fraga et al., 1988). به‌طور خلاصه: 1/0 میلی لیتر هموژنات بافتی با 2 میلی­لیتر معرفThiobarbituric acid;TBA-trichloroacetic acid;TCA-Hcl   (37% TBA، 25/0 مول HCL و 15% TCA، به نسبت 1:1:1) مخلوط و پس از 15 دقیقه  قرارگیری در بن‌ماری‌جوشان، خنک گردید و در g 3500 به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شد. شدت جذب محلول رویی شفاف در nm 535 در مقابل بلانک اندازه­گیری گردید. مقادیر به صورت نانومول بر100 گرم بافت بیان شدند.

   فعالیت سوپراکسید دیسموتاز توسط روش نیشیکیمی و همکاران در سال 1972 تعیین گردید (Nishikimi et al., 1972). در حدود 5 میکروگرم از پروتئین­های تام هر یک از هموژنات­های روده با بافر پیروفسفات سدیم، فنازین متوسولفات (PMT phenazine methosulfate;) و نیترو-بلو تترازولیوم (Nitro-blue Tertazolium; NBT) مخلوط گردید. واکنش با افزودن نیکوتین­آمید-آدنین دی­نوکلئوتید (Nicotinamide-adenine dinucleotide; NADH) آغاز شد. مخلوط واکنش در دمای 30 درجه سلسیوس به مدت 90 ثانیه انکوبه و با افزودن 1 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال متوقف گردید. شدت جذب مخلوط رنگ­زای تشکیل شده در nm560 اندازه­گیری شد. هر واحد از فعالیت سوپراکسید دیسموتاز به صورت غلظت آنزیم مورد نیاز برای ممانعت از تولید رنگ تا 50 درصد در 1 دقیقه، تحت شرایط مطالعه، تعیین گردید.

   فعالیت کاتالاز توسط روش کلایبورنه در سال 1985 و بر اساس تجزیه پراکسید هیدروژن در nm240، مورد سنجش قرار گرفت (Claiborne, 1985). به طور خلاصه، مخلوط مورد سنجش متشکل از 95/1 میلی­لیتر بافر فسفات (7M, pH=  05/0)، 1 میلی­لیتر پرکسید هیدروژن (M 019/0) و 05/0 میلی­لیتر PMS (10%) در حجم نهایی 3 میلی‌لیتر بود. تغییرات در جذب، در nm240 اندازه‌گیری شد. در نهایت نتیجه به شکل "فعالیت کاتالاز در دقیقه" محاسبه گردید.

   فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز با استفاده از روش روتروک و همکاران (Rotruck et al., 1973) و بر اساس واکنش ذیل مورد سنجش قرار گرفت.

H2O2 + 2GSH→ 2H2O + GSSG

   گلوتاتیون پراکسیداز، در هموژنات بافتی، گلوتاتیون را اکسیده کرده که به طور هم زمان پراکسید هیدروژن به آب احیاء می­گردد. این واکنش پس از 10 دقیقه توسط تری‌کلرواستیک اسید متوقف و گلوتاتیون باقی‌مانده توسط محلول دی­تیوبیس نیتروبنزوئیک اسید (Dithiobis nitrobenzoic acid; DTNB) مجدداً فعال گردیده و منجر به تشکیل ترکیب رنگی می­گردد که با اسپکتروفتومتر در nm420 اندازه­گیری می­شود. مخلوط واکنشگر متشکل از 2/0 میلی‌لیتر اتیلن دی­آمین تترا-استیک اسید (ethylenediamine tetra-acetic acid; EDTA) mM8/0، 1/0 میلی­لیتر آزید سدیم (sodium azide) mM10، 1/0 میلی­لیتر پراکسید هیدروژن mM5/2 و 2/0 میلی­لیتر هموژنات بود که در 37 درجه ‌سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه انکوبه گردید. واکنش با افزودن 5/0 میلی­لیتر تری‌کلرواستیک اسید 10 درصد متوقف و لوله­ها با 2000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. 3 میلی­لیتر دی­سدیم هیدروژن mM 8/0 و 1/0 میلی­لیتر DTNB 04/0 درصد به محلول شناور افزوده شد و بلافاصله رنگ حاصله در nm420 اندازه­گیری شد. فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز به صورت میلی­گرم پروتئین/دقیقه/میکرومول گلوتاتیون اکسید بیان گردید.

   فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز با استفاده از روش مهنداس و همکاران در سال 1984 (Mohandas et al., 1984) بر اساس واکنش ذیل مورد سنجش قرار گرفت.

NADPH + H+ + GSSG → NADP+ + 2GSH

   در حضور گلوتاتیون ردوکتاز، گلوتاتیون اکسیده، احیاء گردیده و هم­زمان، NADPH به NADP+ اکسیده می­شود. فعالیت آنزیم در دمای اتاق و با ناپدید شدن میزان NADPH در دقیقه با اندازه­گیری اسپکتروفتومتری کاهش جذب نوری در nm340، تعیین گردید.

   برای آسیب­شناسی بافتی، حدود 5 سانتی­متر از ژژنوم پروگزیمال برداشته شد. لومن روده بلافاصله با استفاده از فسفات بافر سالین پاک شده و برای پایدارسازی بافت روده، فرمالین 10٪ با استفاده از یک سرنگ 20 میلی لیتری از یک انتهای روده به داخل آن تزریق شد. برای پایدارسازی بیشتر، نمونه­ها به داخل  محلول فرمالین 10٪ منتقل شدند. از نمونه­های پایدارشده در فرمالین، برش‌هایی با ضخامت 5 میکرون و با روش رنگ‌آمیزی معمول هماتوکسیلین-ائوزین تهیه شد (Lee and Luna, 1988). شدت آسیب روده با یک مقیاس نیمه­کمی و دوسو بی­خبر بر اساس روش ارائه شده توسط گلگون و همکاران در سال 2010 ارزیابی شد. کوتاه شدن پرزهای روده در هر حیوان به صورت: صفر، طبیعی؛ 1، کوتاه شدن ملایم؛ 2، کوتاه شدن متوسط، 3، کوتاه شدن شدید؛ و 4، مشاهده نشدن پرز درجه­بندی شد. زخم شدن مخاط روده به صورت: صفر، طبیعی؛ 1، جدا شدن اپیتلیوم مخاط؛ 2، از بین رفتن کامل اپیتلیوم مخاط، 3، از بین رفتن کامل پرز؛ و 4، تخریب لایه عضلانی درجه­بندی شد.  میزان آماس به صورت: صفر، طبیعی؛ 1، ارتشاح کانونی سلول‌های آماسی؛ 2، ارتشاح جزئی سلول­های آماسی فقط در لامینا پروپریا، 3، آماس روده در لامینا پروپریا؛ و 4، آماس شدید روده که به لایه عضلانی نیز گسترش یافته است، درجه­بندی شد (Gulgun et al., 2010). آسیب‌شناسی بافتی با میکروسکوپ نوری مدل نیکون (ECLIPSE E200، ساخت کشور ژاپن) و عدسی چشمی 10× انجام شد.

تحلیل آماری داده­ها: داده‌های به‌دست آمده کمی، به صورت mean±S.E.M ارائه و اختلاف معنی‌دار بین گروه‌ها توسط آزمون تحلیل واریانس یک‌طرفه و آزمون تعقیبی توکی در سطح معنی‌داری 05/0p< با نرم‌افزار آماری SPSS مورد واکاوی آماری قرار گرفت.

 

یافته‌ها

   در موش‌های صحرایی گروه شاهد جراحی، هیچ­گونه تغییر معنی­داری در پارامترهای مورد آزمایش در مقایسه با گروه شاهد ایجاد نشد. در موش‌های صحرایی گروه ایسکمی- خون­رسانی مجدد، فعالیت تام آنتی­اکسیدانی سرم و آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز بافت ژوژنوم در مقایسه با گروه شاهد، به­طور معنی­داری (000/0p=) کاهش و میزان مالون­دی­آلدئید به طور معنی­داری (000/0p=) افزایش یافت. در گروه­ ایسکمی- خون­رسانی مجدد و تیمار با نارینژنین، نارینژنین به طور معنی­داری (000/0p=) مانع از افزایش مالون‌دی‌آلدئید و هم­چنین مانع از کاهش فعالیت تام آنتی­اکسیدانی سرم و آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز در اثر ایسکمی و خون­رسانی مجدد شد، طوری که تفاوت معنی­داری بین این گروه و گروه شاهد مشاهده نشد (جدول 1).

   مقایسه آسیب­شناسی بافتی ژوژنوم موش­های صحرایی گروه­های مورد مطالعه به­طور کمّی در جدول 2 آورده شده است. در مطالعات ریزبینی، ساختار بافتی ژوژنوم در موش­های صحرایی گروه شاهد کاملاً طبیعی و سالم بود (شکل 1). آسیب بافتی قابل ملاحظه­ای نیز در مخاط ژوژنوم موش­های صحرایی گروه شاهد جراحی، مشاهده نشد و بافت ژوژنوم این گروه، سالم و طبیعی به نظر می­رسید (شکل 2). در بافت ژوژنوم موش­های صحرایی گروه ایسکمی- خون­رسانی مجدد ، تغییرات بافتی شامل ارتشاح فراوان سلول­های آماسی، کاهش ارتفاع پرزها و زخم شدن مخاط روده به­طور معنی­داری (000/0=p) در مقایسه با گروه شاهد مشاهده شد (شکل 3). در گروه ایسکمی- خون­رسانی مجدد و تیمار با نارینژنین، نارینژنین به­طور معنی­داری (000/0=p) مانع از بروز آسیب­های بافتی شدید ژوژنوم موش­ها شد و آسیب­ها فقط شامل کاهش بسیار جزئی ارتفاع پرزها، نکروز تعداد کمی از سلول­های اپیتلیالی رأس پرزها و ارتشاح کانونی و بسیار اندک سلول­های التهابی در مخاط روده تعدادی از موش­ها بود (شکل 4)، به‌طوری که اختلاف معنی­داری بین این گروه و گروه شاهد مشاهده نشد.

 

 

 

جدول 1- مقایسه پارامترهای بیوشیمیایی مورد آزمایش بین گروه­های تحت مطالعه

گرو­ها

پارامترهای بیوشیمیایی

 

 

 

فعالیت تام آنتی‌اکسیدانی (micmol/l)

مالون‌دی‌آلدئید (nmol/g tissue)

سوپراکسید دیسموتاز

(mU/mg protein)

کاتالاز

(U/mg protein)

گلوتاتیون پراکسیداز (U/mg protein)

گلوتاتیون ردوکتاز (U/mg protein)

 

شاهد

48/0±59/1a

85/5±27/41 a

43/2±14/7a

03/0±14/0a

51/0±57/3a

75/2±72/5a

 

 

شاهد جراهی

39/0±62/1a

67/4±32/39a

15/2±27/7a

04/0±15/0a

65/0±49/3a

41/2±43/5a

 

 

ایسکمی-خونرسانی مجدد

29/0±07/1b

74/9±48/80b

68/1±39/3b

01/0±09/0b

42/2±98/7b

16/3±11/8b

 

 

ایسکمی-خونرسانی مجدد و  تیمار با نارینژنین

45/0±57/1a

12/5±26/38a

25/2±98/6a

02/0±13/0a

66/0±50/3a

70/2±24/5a

 

                         

مقادیر به­صورت میانگین ± انحراف معیار برای 10 سر موش صحرایی در هر گروه ارائه شده است.

a,b: حروف غیرمشابه در هر ستون نشانگر اختلاف معنی­دار است (05/0p<).

 

جدول 2- مقایسه شدت آسیب بافت ژوژنوم بین گروه­های مورد مطالعه

گرو­ها

شدت آسیب در بافت ژوژنوم

کاهش ارتفاع پرزها

آماس

زخم

شاهد

b0/0±00/0

b0/0±00/0

b0/0±00/0

شاهد جراهی

b0/0±00/0

b0/0±00/0

b0/0±00/0

ایسکمی-خونرسانی مجدد

a31/0±52/3

a37/0±66/2

a48/0±56/2

ایسکمی-خونرسانی مجدد و  تیمار با نارینژنین

b05/0±48/0

b04/0±35/0

b07/0±29/0

                          مقادیر به­صورت میانگین ± انحراف معیار برای 10 سر موش صحرایی در هر گروه ارائه شده است.

a,b                                   : حروف غیرمشابه در هر ستون نشانگر اختلاف معنی­دار است (05/0p<).

 

 

 

شکل 1- نمای میکروسکوپی از بافت ژوژنوم یک موش صحرایی از گروه‌ شاهد:  بافت ژوژنوم کاملاً سالم و طبیعی است (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشت‌نمایی 40×).

 

شکل 2- نمای میکروسکوپی از بافت ژوژنوم یک موش صحرایی از گروه‌ شاهد جراحی: آسیب بافتی قابل ملاحظه­ای در بافت ژوژنوم مشاهده نمی­شود (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشت‌نمایی 40×).

 

 

شکل 3- نمای میکروسکوپی از بافت ژوژنوم یک موش صحرایی از گروه ایسکمی-خون­رسانی مجدد: نکروز و جدا شدن بافت پوششی مخاط روده و تخریب رأس پرزها (پیکان­های ضخیم)، همراه با حضور فراوان سلول­های آماسی (پیکان­های باریک) و خون­ریزی (نوک پیکان‌ها) در مخاط بافت ژوژنوم مشاهده می­شود (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشت‌نمایی 40×).

 

 

 

 

 

شکل 4- نمای میکروسکوپی از بافت ژوژنوم یک موش صحرایی از گروه ایسکمی-خون­رسانی مجدد به­علاوه تیمار با نارینژنین: کاهش جزئی ارتفاع پرزها، نکروز تعداد اندکی از سلول­های بافت پوششی رأس پرزها (پیکان‌های ضخیم) و حضور کم سلول­های آماسی (پیکان‌های باریک) در بافت ژوژنوم قابل مشاهده است  (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشت‌نمایی 40×).


بحث و نتیجه‌گیری

   در بررسی حاضر، مطالعه ریزبینی بافت ژوژنوم تغییرات آماسی، آتروفی پرزها و زخم­های مخاطی روده را در اثر آسیب ایسکمی-خون­رسانی مجدد نشان داد که این یافته با نتایج مطالعه آبدین و همکاران در سال 2011 هم­خوانی دارد (Abdeen et al., 2011). در این مطالعه افزایش پراکسیداسیون لیپیدی و کاهش فعالیت آنتی­اکسیدانی در بافت ژوژنوم، نشان داد که استرس‌اکسیداتیو ناشی از رادیکال­های آزاد، یکی از مکانیسم­های احتمالی در پاتوفیزیولوژی آسیب ایسکمی-خون­رسانی مجدد روده­ای می­باشد. اثرات آسیب­رسان خون­رسانی مجدد بر مخاط روده پس از یک دوره کاهش خون­رسانی، به دلیل اثرات متقابل پیچیده­ فاکتورهای متعددی در گردش خون مخاطی است که در نهایت منجر به درجات متفاوتی از آسیب مخاط خواهد شد. یکی از مکانیسم­های اصلی موثر در این روند آسیب، تولید موضعی گونه­های فعال اکسیژن می­باشد. مطالعات انجام شده توسط ترزی و همکاران در سال 2010 و اکودان و همکاران در سال 2013 نیز نقش استرس اکسیداتیو در آسیب ناشی از ایسکمی-خون­رسانی مجدد در روده را مورد تائید قرار می­دهد (Terzi et al., 2010; Okudan et al., 2013).

   وجود التهاب در بافت مخاطی روده نیز حاکی از وقوع استرس اکسیداتیو در این بافت می­باشد که با افزایش پراکسیداسیون لیپیدی  و کاهش محتوای گلوتاتیون احیا اثبات می­گردد (Viswa et al., 2007).

   افزایش تجمع نوتروفیل و تولید گونه­های فعال اکسیژن باعث اختلال در گردش خون مویرگی مخاط روده شده و نقشی اساسی را در ایجاد زخم در این بافت برعهده دارد (5). گونه­های فعال اکسیژن تجمع لکوسیت­ها را در بافت­ها سبب می­شود. لکوسیت­ها­ی فعال آنزیم­هایی مانند میلوپراکسیداز، الاستاز و پروتئازها را ترشح کرده و رادیکال­های آزاد بیشتری را تولید می‌کنند (Kremer, 2004; Miyazono et al., 2004; Sener et al., 2006).

   هم‌چنین گونه­های فعال اکسیژن باعث افزایش نفوذپذیری در سلو­ل­های توپوشی عروق و بافت پوششی می­شود. افزایش در نفوذ­پذیری روده باعث می‌شود که باکتری­ها و آندوتوکسین­ها  از سد روده­ای نفوذ کرده و سبب ایجاد آماس و تولید بیشتر گونه­های فعال اکسیژن در آن گردند. گونه­های فعال اکسیژن از طریق واکنش با اسید­های چرب غیر­اشباع غشاهای سلولی، اسیدهای نوکلئیک و باندهای سولفیدریل پروتئین­ها، باعث آسیب روده در اثر استرس اکسیداتیو ناشی از آسیب ایسکمی-خون­رسانی مجدد می­شوند (Mallck et al., 2004). بدین ترتیب، پراکسیداسیون لیپیدی، که در آسیب غشاهای سلولی میزان آن افزایش پیدا می­کند، اتفاق می­افتد. افزایش میزان مالون­دی­آلدئید در موش­های دچار آسیب ایسکمی-خون­رسانی مجدد اهمیت پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از گونه­های فعال اکسیژن را در این نوع آسیب روده­ای مشخص می­کند.

   در بررسی حاضر کاهش معنی­دار فعالیت تام آنتی‌اکسیدانی سرم و آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز مشاهده شد که این یافته با نتایج مطالعه ترزی  و همکاران در سال 2010، آبدین و همکاران در سال 2011  و اکودان و همکاران در سال 2013 هم­خوانی دارد (Terzi et al., 2010; Abdeen et al., 2011; Okudan et al., 2013).  ایشان این تغییرات را به پاسخ بافت به استرس اکسیداتیو ناشی از بازخون­رسانی بافت نسبت داده­اند.

   کاهش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز شاخصی دقیق برای آسیب سلول­ها است. این آنزیم یکی از مهم­ترین عوامل در سیستم دفاعی آنتی­اکسیدانی آنزیمی به شمار می­رود. سوپراکسید دیسموتاز، آنیون سوپراکسید را با تبدیل آن به پراکسید هیدروژن از محل زدوده و بدین ترتیب اثرات سمّی آن را کاهش می­دهد (Curtis et al., 1972). در مطالعه ما، میزان سوپراکسید دیسموتاز در بافت روده موش­های صحرایی دچار آسیب ایسکمی- خون­رسانی مجدد به دلیل تشکیل فراوان آنیون­های سوپراکسید، به طور معنی­داری کاهش یافت که به دنبال آن فعالیت آنزیم­های زداینده پراکسید هیدروژن یعنی کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز نیز به طور معنی­داری کاهش یافت. غیرفعال شدن سوپراکسید دیسموتاز توسط آنیون­های افزایش یافته سوپراکسید، منجر به غیرفعال شدن آنزیم­های کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز می­شود. کاتالاز با تجزیه پراکسید هیدروژن بافت­ها را در برابر رادیکال­های بسیار فعال هیدروکسیل محافظت می­کند. بنابراین، کاهش فعالیت کاتالاز ممکن است به بروز اثرات مخرب ناشی از رادیکال سوپراکسید و پراکسید هیدروژن منجر شود (Chance et al., 1952).

   در مطالعه ما فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز که برای تولید مجدد گلوتاتیون احیا ضروری است، متعاقب آسیب ایسکمی-خون­رسانی مجدد به­طور معنی­داری کاهش یافت. کاهش فعالیت این آنزیم ممکن است دلیلی برای کاهش پاک­سازی گونه­های فعال اکسیژن توسط گلوتاتیون احیا باشد که به آسیب اکسیداتیو بافت روده منجر می­شود.  گلوتاتیون ردوکتاز یک آنزیم سیتوزولی است که در کاهش گلوتاتیون اکسید، به عنوان محصول نهایی فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز روی گلوتاتیون احیا، دخالت دارد (Naik and Panda; 2008).

   اغلب گزارش­ها نشان داده­اند که استفاده از آنتی‌اکسیدان­ها باعث کاهش اثرات مخرب خون­رسانی مجدد در مخاط روده می­شود (Ozkan et al., 2009; Ustundag et al., 2000; Chen et al., 2007; Teke et al., 2007; Berber et al., 2009).

   در این مطالعه، موش­های گروه ایسکمی- بازخون­رسانی به­علاوه تیمار با نارینژنین، نارینژنین  را به طور تازه با حل کردن پودر در حلال دی­متیل­سولفوکسید، به میزان mg/kg20 از راه تزریق داخل صفاقی، 120 دقیقه قبل از القا ایسکمی دریافت کردند. نتایج نشان داد که مخاط روده موش­های این گروه ساختار خود را در حدی نزدیک به حالت طبیعی حفظ کرده است. این یافته با گزارشات سایر محققین که انواع مختلف آنتی‌اکسیدان­ها را مورد استفاده قرار داده بودند، در توافق می­باشد (Yildiz et al., 2009; Yildiz et al., 2010).

   در این مطالعه مصرف نارینژنین مانع از کاهش فعالیت تام آنتی­اکسیدانی سرم و آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز در اثر آسیب ایسکمی-خون­رسانی مجدد شد. این اتفاق ممکن است در اثر زدایش رادیکال­های آزاد توسط نارینژنین باشد که باعث حفظ این آنزیم­ها شده است. در هر صورت، نتایج بیوشیمیایی، در توافق با نشانه‌ها و شواهد، با یافته­های مشاهدات ریزبینی به‌دست آمده از این بررسی نیز هم­راستا بود. 

   نتایج بررسی حاضر، گزارش سایر محققین در خصوص اثرات آنتی­اکسیدانی و زدایش رادیکال­های آزاد توسط نارینژنین را مورد تائید قرار می­دهد. تحقیقاتی که توسط تستای و همکاران در سال 2013 به انجام رسیده است اثرات مفید آنتی اکسیدانی نارینژنین بر آسیب ایسکمی- خون­رسانی مجدد میوکارد قلب را به اثبات رسانده است (Testai et al., 2013). رازا و همکاران در سال 2013 نشان دادند که نارینژنین می‌تواند بافت عصبی را با خواص آنتی­اکسیدانی خود از آسیب ایسکمی- خون­رسانی مجدد محافظت کند (Raza et al., 2013). مطالعات انجام شده توسط آلنستیل و همکاران در سال 2006 اثرات محافظتی آنتی‌اکسیدانی نارینژنین را در برابر آسیب ایسکمی- خون­رسانی مجدد کلیه به اثبات رسانده است (Ahlenstiel et al., 2006). دمبینسکی و همکاران در سال 2004 مشخص نمودند که نارینژنین با خواص آنتی­اکسیدانی خود آسیب ایسکمی- خون­رسانی مجدد پانکراس را کاهش می­دهد (Dembinski et al., 2004). اثرات محافظتی نارینژنین بر آسیب ایسکمی- خون‌رسانی مجدد بافت شبکیه توسط کارا و همکاران در سال 2014 به اثبات رسیده است (Kara et al., 2014).

   با توجه به مجموعه فوق­الذّکر، نارینژنین با استفاده از خواص آنتی­اکسیدانی خود، بافت ژوژنوم موش­های صحرایی را در برابر آسیب ایسکمی-خون­رسانی مجدد محافظت می­کند. بنابراین، نارینژنین می‌تواند پس از انجام کارآزمایی‌های بالینی و کسب نتایج مفید، در موارد انسداد اختناقی روده، جراحی­های قلبی-عروقی، جراحی آئورت بطنی و پیوند روده که آسیب ایسکمی-خون­رسانی مجدد روده مشکلات جدی را برای بیمار فراهم می­کند (Mallick et al., 2005)، مورد استفاده قرار گیرد. به هرحال تاثیر دزهای مختلف نارینژنین، مکان و مکانیسم یا مکانیسم‌های مولکولی و سلولی مؤثر در عملکرد فارماکولوژیکی نارینژنین ناشناخته مانده و نیاز به مطالعات آتی دارد. 

  • · Abdeen, S.M., Mathew, T.C., Dashti, H.M., and Asfar, S. (2011). Protective effects of green tea on intestinal ischemia-reperfusion injury. Nutrition, 27(5): 598-603.
  • · Ahlenstiel, T., Burkhardt, G., Köhler, H. and Kuhlmann, M.K. (2006). Improved cold preservation of kidney tubular cells by means of adding bioflavonoids to organ preservation solutions. Transplantation, 81(2): 231-239.
  • · Arul, D. and Subramanian, P. (2013). Inhibitory effect of naringenin (citrus flavonone) on N-nitrosodiethylamine induced hepatocarcinogenesis in rats. Biochemical and Biophysical Research Communications, 434: 203-209.
  • · Asfar, S., Zhong, R. and Grant, D.  (1994). Small bowel transplantation. Surgical Clinics of North America, 74: 1197-1210.
  • · Berber, I., Aydin, C., Cevahir, N., Yenisey, C., Gumrukcu, G., Kocbil, G., et al. (2009). Tempol reduces bacterial translocation after ischemia/reperfusion injury in a rat model of superior mesenteric artery occlusion. Surgery Today, 39: 407-413.
  • · Chance, B., Greenstein, D.S. and Roughton, R.J.W. (1952). The mechanism of catalase action. 1. Steady-state analysis. Archives of Biochemistry and Biophysics, 37(2): 301-321.
  • · Chen, C.F., Hsueh, C.W., Tang, T.S., Wang, D., Shen, C.Y. and Pei, J.S. (2007). Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and protective effect of N-acetyl cysteine. Transplantation Proceedings, 39: 858-860.
  • · Chiou, G.C.Y. and Xu, X. (2004). Effects of some natural flavonoids on retinal function recovery after ischemic insult in the rat. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, 20(2): 107-113.
  • · Choi, E.J. and Ahn, W.S. (2008). Neuroprotective effects of chronic hesperetin administration in mice. Archives of Pharmacal Research, 31(11): 1457-1462.
  • ·  Cicales, L., Sileri, P., Green, M., Abu-Elmagd, K., Kocoshis, S. and Reyes, J. (2001). Bacterial translocation in clinical transplantation. Transplantation, 71: 1414-1417.
  • · Claiborne, A. (1985). Catalase activity In: Boca Raton FL, editor. CRC Handbook of methods for oxygen radical research. Florida: CRC Press, Boca Raton, pp: 283-284.
  • · Collard, C.D. and Gelman, S. (2001). Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology, 94(6): 1133-1138.
  • Curtis, S.J., Mortiz, M. and Sondgrass, P.J. (1972). Serum enzymes derived from liver cell fractions. I. The response to carbon tetrachloride intoxication in rats. Gastroentrology, 62(1): 84-92.
  • · Dembinski, A., Warzecha, Z., Konturek, S.J., Ceranowicz, P., Dembinski, M., Pawlik, W.W., et al. (2004). Extract of grapefruit-seed reduces acute pancreatitis induced by ischemia/reperfusion in rats; possible implication of tissue antioxidants. Journal of Physiology and Pharmacology, 55(4): 811-821.
  • · Fraga, C.G., Leibovitz, B.E. and Tappel, A.L. (1988). Lipid peroxidation measured as thiobarbituric acid-reactive substances in tissue slices: characterization and comparison with homogenates and microsomes. Free Radical Biology and Medicine, 4(3): 155-161.
  • · Gulgun, M., Erdem, O., Ozta, E., Kesik, V., Balamtekin, N., Vurucu, S., et al. (2010): Proanthocyanidin prevents methotrexate-induced intestinal damage and oxidative stress. Experimental and Toxicologic Pathology, 62(2): 109-115.
  • · Haidari, F., Keshavarz, S.A., Rashidi, M.R., and Shahi, M.M. (2009). Orange juice and hesperetin supplementation to hyperuricemic rats alter oxidative stress markers and xanthine oxidoreductase activity. Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition, 45(3): 285-291.
  • · Hirai, S., Kim, Y.I., Goto, T., Kang, M.S., Yoshimura, M., Obata, A., et al. (2007). Inhibitory effect of naringenin chalcone on inflammatory changes in the interaction between adipocytes and macrophages. Life Science, 81: 1272-1279.
  • · Jain, A., Yadav, A., Bozhkov, A.I., Padalko, V.I. and Flora, S.J. (2011). Therapeutic efficacy of silymarin and naringenin in reducing arsenic-induced hepatic damage in young rats. Ecotoxicology and Environmental Safety, 74: 607-614.
  • · Jong-Hwa, P., Jin-Woo, L., Hyun-Dong, P., Ssang-Goo, C., Seung-Yeol, N., Yong-Sun, P., et al. (2010). Cytotoxic Effects of 7-O-Butyl Naringenin on Human Breast Cancer MCF-7 Cells. Food Science and Biotechnology, 19: 717-724.
  • · Kara, S., Gencer, B., Karaca, T., Tufan, H.A., Arikan, S., Ersan, I., et al. (2014). Protective Effect of Hesperetin and Naringenin against Apoptosis in Ischemia/Reperfusion-Induced Retinal Injury in Rats. Scientific World Journal, 797824.
  • · Kawaii, S., Tomono, Y., Katase, E., Ogawa, E. and Yano M. (1999). Quantitation of flavonoid constituents in Citrus fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47(9): 3565-3571.
  • · Kinoshita, T., Lepp, Z., Kawai, Y., Terao, J. and Chuman H. (2006). An integrated database of flavonoids. BioFactors, 26(3): 179-188.
  • · Koike, K., Moore, F.A., Moore, E.E., Read, R.A., Carl, V.S. and Banerjee, A. (1993). Gut ischemia mediates lung injury by a xanthine oxidasedependent neutrophil mechanism. Journal of Surgical Research, 54(5): 469-473.
  • · Kremer, J.M. (2004): Toward a better understanding of methotrexate. Arthritis and Rheumatology, 50:1370-1382.
  • · Lee, J. and Kim, G. (2010). Evaluation of antioxidant and inhibitory activities for different subclasses flavonoids on enzymes for rheumatoid arthritis. Journal of Food Science, 75(7): H212-H217.
  • · Lee, G. and Luna, H.T. (1988). Manual of histologic staining methods of the armed forces institute of pathology. Third Edition. The Blakiston Division Mc Graw. Hill Book Company, pp: 32-107.
  • · Lisa, J., Wilcox, M. and Borradaile, W. (1999). Antiatherogenic Properties of Naringenin, a Citrus Flavonoid. Cardiovascular Drug Reviews, 17:160-178.
  • ·  Mallick, J.H., Yang, W.X., Winslet, M.C. and Seifalian, A.M. (2004). Ischemia–reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Digestive Diseases and Sciences, 49: 1359-1377.
  • · Mallick, J.H., Yang, W.X., Winslet, M.C. and Seifalian, A.M. (2005). Pyrrolidine dithiocarbamate reduces ischemia-reperfusion injury of the small intestine. World Journal of Gastroenterology 11:7308-7313.
  • · Miller, N.J., Rice-Evans, C., Davies, M.J., Gopinathan, V. and Milner, A. (1993). A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates. Clinical Science, 84: 407-412.
  • · Miyazono, Y., Gao, F. and Horie, T. (2004). Oxidative stress contributes to methotrexate-induced small intestinal toxicity in rats. Scand. Journal of Gastroenterology, 39(11): 1119-1127.
  • · Miyake, Y., Minato, K., Fukumoto, S., Yamamoto, K., Oya-ito, T., Kawakishi, S., et al. (2003). New potent antioxidative hydroxyflavanones produced with Aspergillus saitoi from flavanone glycoside in citrus fruit. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 67(7): 1443-1450.
  • · Mohandas, J., Marshall, J.J., Duggin, G.G., Horvath, J.S. and Tiller, D.J. (1984). Low activities of glutathione-related enzymes as factors in the genesis of urinary bladder cancer. Cancer Research, 44(11): 5086-5091.
  • · Moore, E.E., Moore, F.A., Franciose, R.J., Kim, F.J., Biffl, W.L. and Banerjee, A. (1994). The postischemic gut serves as a priming bed for circulating neutrophils that provoke multiple organ failure. Journal of Trauma, 37(6): 881-887.
  • · Mulvihill, E.E., Allister, E.M., Sutherland, B.G., Telford, D.E., Sawyez, C.G., Edwards, J.Y., et al. (2009).  Markle JM, Hegele RA, Huff MW. Naringenin prevents dyslipidemia, apolipoprotein B overproduction, and hyperinsulinemia in LDL receptor-null mice with diet-induced insulin resistance. Diabetes, 58: 2198-2210.
  • · Naik, S.R. and Panda, V.S. (2008). Hepatoprotective effect of Ginkgoselect phytosome® in rifampicin induced liver injury in rats: Evidence of antioxidant activity. Fitoterapia, 79(6): 439-445.
  • · Nalini, N., Aranganathan, S. and Kabalimurthy, J. (2012). Chemopreventive efficacy of hesperetin (citrus flavonone) against 1, 2-dimethylhydrazine-induced rat colon carcinogenesis. Toxicology Mechanisms and Methods, 22: 397-408.
  • · Nishikimi, M., Appaji, N. and Yagi, K. (1972). The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen. Biochemical and Biophysical Research Communications, 46(2): 849-854.
  • · Okudan, N., Belviranli, M., Gökbel, H., Oz M. and Kumak A. (2013). Protective effects of curcumin supplementation on intestinal ischemia reperfusion injury. Phytomedicine, 20(10): 844-848.
  • · Oršolić, N., Gajski, G., Garaj-Vrhovac, V., Dikić, D., Prskalo, Z.Š. and Sirovina, D. (2011). DNA-protective effects of quercetin or naringenin in alloxan-induced diabetic mice. European Journal of Pharmacology, 656: 110-118.
  • · Ortiz-Andrade, R.R., Sánchez-Salgado, J.C., Navarrete-Vázquez, G., Webster, S.P., Binnie, M., García-Jiménez, S., et al. (2008). Antidiabetic and toxicological evaluations of naringenin in normoglycaemic and NIDDM rat models and its implications on extra-pancreatic glucose regulation. Diabetes, Obesity and Metabolism, 10: 1097-1104.
  • · Ozkan, O.V., Yuzbasioglu, M.F., Ciralik, H., Kurutas, E.B., Yonden Z., Aydin, M., et al. (2009). Resveratrol, a natural antioxidant, attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury in rats. Tohoku Journal of Experimental Medicine, 218: 251-258.
  • · Pollard, S.E., Whiteman, M. and Spencer, J.P.E. (2006). Modulation of peroxynitrite-induced fibroblast injury by hesperetin: a role for intracellular scavenging and modulation of ERK signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications, 347(4): 916-923.
  • · Rahigude, A., Bhutada, P., Kaulaskar, S., Aswar, M. and Otari, K. (2012). Participation of antioxidant and cholinergic system in protective effect of naringenin against type-2 diabetes-induced memory dysfunction in rats. Neuroscience, 226:62-72.
  • · Raza, S.S., Khan, M.M., Ahmad, A., Ashafaq, M., Islam, F., Wagner, A.P., et al. (2013). Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke. Neuroscience, 230: 157-171.
  • · Rotruck, J.T., Pope, A.L., Ganther, H.E., Swanson, A.B., Hafeman, D.G. and Hoekstra, W.G. (1973). Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science, 179(73): 588-590.
  • · Sener, G., Eksioglu-Demiralp, E., Cetiner, M., Ercan, F. and Yegen, B.C. (2006). β glucan ameliorates methotrexate induced oxidative organ injury via its antioxidant and immunomodulatory effects. European Journal of Pharmacology, 542: 170-178.
  • · Swank, G.M. and Deitch, E.A. (1996). Role of the gut in multiple organ failure: Bacterial translocation and permeability changes. World Journal of Surgery, 20(4): 411-417.
  • · Teke, Z., Kabay, B., Aytekin, F.O., Yenisey, C., Demirkan, N.C., Sacar, M., et al. (2007). Pyrrolidine dithiocarbamate prevents 60 minutes of warm mesenteric ischemia/reperfusion injury in rats. American Journal of Surgical Pathology, 194: 255-262.
  • · Terzi, A., Coban, S., Yildiz, F., Ates, M., Bitiren, M., Taskin, A., et al. (2010). Protective effects of Nigella sativa on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Journal of Investigative Surgery, 23(1): 21-27.
  • · Testai, L., Martelli, A., Cristofaro, M., Breschi, M.C. and Calderone V. (2013). Cardioprotective effects of different flavonoids against myocardial ischaemia/reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics, 65: 750-756.
  • · Ustundag, B., Kazez, A., Demirbag, M., Canatan, H., Halifeoglu, I. and Ozercan, I.H. (2000). Protective effect of melatonin on antioxidative system in experimental ischemia–reperfusion of rat intestine. Cellular Physiology and Biochemistry, 10: 229-236.
  • · Viswa, K.K., Premila, A. and Bina, I. (2007). Alteration in antioxidant defense mechanisms in the small intestines of methotrexate treated rat may contribute to its gastrointestinal toxicity. Cancer Therapy, 5: 501-510.
  • · Yamamoto, S., Tanabe, M., Wakabayashi, G., Shimazu, M., Matsumoto, K. and Kitajima, M. (2001). The role of tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1 beta in ischemia–reperfusion injury of the rat small intestine. Journal of Surgical Research, 99: 134-141.
  • · Yildiz, Y., Kose, H., Cecen, S., Ergin, K., Demir, E.M. and Serter, M. (2010). Protective effect of leflunomide on intestinal ischemia–reperfusion injury: leflunomide against intestinal ischemia–reperfusion. Digestive Diseases and Sciences, 55: 245-252.
  • · Yildiz, Y., Serter, M., Ek, R.O., Ergin, K., Cecen, S., Demir, E.M. and Yenisey, C. (2009). Protective effect of caffeic acid phenethyl ester on intestinal ischemia–reperfusion injury. Digestive Diseases and Sciences, 54: 738-744.
  • · Zbarsky, V., Datla K.P., Parkar, S., Rai, D.K., Aruoma, O.I. and Dexter, D.T. (2005). Neuroprotective properties of the natural phenolic antioxidants curcumin and naringenin but not quercetin and fisetin in a 6-OHDA model of Parkinson’s disease. Free Radical Research, 39: 1119-1125.