بررسی تاثیر جوشانده چای سیاه بر پروماستیگوت‌های انگل لیشمانیا ماژور در شرایط برون‌تنی

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

1 موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی کرج، بخش تحقیق و تشخیص بیماری های انگلی.

2 موسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی کرج، بخش تحقیق و تشخیص بیماری‌های انگلی.

3 موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی کرج، بخش تحقیق و تشخیص بیماری های انگلی.

چکیده

   لیشمانیوز جلدی یکی از بیماری­های آندمیک در برخی از نقاط ایران بوده و از جمله بیماری­های انگلی است که فاقد داروی درمانی موثری می­باشد. در این مطالعه، تاثیر جوشانده چای سیاه بر رشد پروماستیگوت­ها در شرایط برون­تنی (In vitro) مورد بررسی قرار گرفت. پروماستیگوت­های لیشمانیا ماژور تکثیر و در پلیت­های کشت سلولی 24 خانه­ای به میزان 3 میلیون انگل در هر میلی­لیتر در محیط تازه پاساژ داده شدند. جوشانده چای سیاه به نسبت­های 10، 20، 30 و 40 درصد حجم نهایی به سوسپانسیون کشت سلولی اضافه گردیده و پلیت­ها به انکوباتور 26 درجه سلسیوس انتقال داده ­شده و در فواصل 5/0، 1، 5، 24، 48 و 72 ساعت پس از مواجهه روند رشد و تکثیر آن­ها ارزیابی گردید. اثربخشی جوشانده چای سیاه بر پروماستیگوت انگل با استفاده از روش شمارش مستقیم و نیز آزمون MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)سنجیده شد و نتایج با استفاده از آزمون تحلیل واریانس یک­طرفه مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. نتابج حاصل از شمارش مستقیم و آزمون MTT نشان داد که تعداد پروماستیگوت‌ها در گروه­های تیمارشده با غلظت­های 10، 20، 30 و 40 درصد جوشانده گیاه چای سیاه 24، 48 و 72 ساعت  پس از کشت کاهش یافته ولی در گروه کنترل از روند رشد طبیعی تبعیت می‌نمود که در مقایسه با گروه‌های تحت آزمایش دارای اختلاف معنی­دار (05/0p<) بود. نتایج مطالعه نشات داد که جوشانده چای سیاه در از بین بردن پروماستیگوت­های لیشمانیا ماژور در شرایط برون­تنی، اثر مطلوبی دارد. 

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

In vitro evaluation of the effect of black tea decoction extract on Leishmania major promastigotes

نویسندگان [English]

  • vahid nasiri 1
  • gholamreza karimi 1
  • habibollah payekari 1
  • gholamreza motamedi 2
  • shahla rivaz 1
  • ebrahim norouzi 3
چکیده [English]

Cutaneous Leishmaniasis is an endemic disease in some parts of Iran and parasites disease without an effective medical treatment.  In this study we attempted to evaluate the antileishmanial effects of the black tea decoction extract as herbal medicines. L. major promastigotes were cultured in RPMI-1640 medium enriched with 10% FCS in the presence of 10, 20, 30 and 40% of extracts. Parasites behavioral reaction and growth pattern was monitored after 0.5, 1, 5, 24, 48 and 72 hours post-seeding by counting fixed parasites in a haemocytometer chamber and observing their motility pattern and shape by invert microscopy. Parasite viability was evaluated by MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) assay.  The results indicated that the number of promastigotes in groups containing 10, 20, 30 and 40% extract had decreased after 24, 28 and 72 hours while normal growth was observed in the control group which was significantly different (p<0.05) in comparison with the treatment groups. This study indicated that black tea decoction extracts could effectively prevent the growth of L. major promastigotes in vitro.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Leishmania major
  • Promastigote
  • MTT
  • Black Tea
  • Herbal medicine

مقدمه

   لیشمانیازیس عفونت انگلی وسیع الطیفی است که موارد عفونت انسانی آن از سراسر جهان به غیر از استرالیا و نواحی قطبی گزارش شده و متاسفانه تاکنون واکسن یا داروی مناسبی برای مهار انگل و اشکال مختلف بیماری و نیز روش شیمیایی مناسبی در مبارزه با ناقل آن ارائه نشده است. عامل لیشمانیازیس تک‌یاخته انگلی از خانواده تریپانوزوماتیده، به نام لیشمانیا است. لیشمانیازیس سبب ایجاد طیف گسترده‌ای از عفونت­های انسانی شامل ضایعات جلدی خودبه­خود بهبود یابنده (سالک) تا اشکال جلدی مخاطی منتشره و گاهاً کشنده احشایی (کالاآزار) می‌گردد.بر طبق گزارش های سازمان بهداشت جهانی این عارضه مهمترین بیماری گرمسیری بوده و هر ساله بیش از بیست میلیون انسان در سراسر جهان به اشکال مختلف بیماری مبتلا گردیده (Castelli et al., 2014) و بیش از 350 میلیون نفر در ریسک ابتلای به عفونت قرار دارند (Nasiri et al., 2013).

   شواهد باستان­شناسی دلالت بر این دارند که ضایعات چهره ناشی از لیشمانیازیس در تصاویر موجود بر روی ظروف سفالی کشف شده در آمریکای مرکزی که قدمت آن­ها به 1000 سال می­رسد و نیز در تصاویر فاتحان اسپانیایی در قرن شانزدهم مشاهده شده­اند (Cox, 2002) . بر طبق گزارشات سازمان بهداشت جهانی 98 کشور و 3 حاکم نشین در 5 قاره از نظر انتقال لیشمانیازیس آندمیک گزارش شده­اند. در مجموع، بر اساس موارد رسمی اعلام شده در جهان هر ساله بیش از 58000 مورد لیشمانیازیس احشایی و 220000 مورد لیشمانیازیس جلدی روی می­دهد (Alvar et al., 2012).

   کشور ایران در میان 10 کشوری قرار گرفته ­است که طبق گزارشات سازمان بهداشت جهانی بیش از 75-70 درصد موارد جهانی لیشمانیازیس جلدی از آن­ها گزارش شده است. ایران در منطقه خاورمیانه از نظر ابتلا به لیشمانیازیس جلدی در رتبه نخست و از نظر ابتلا به لیشمانیازیس احشایی در رتبه چهارم قرار دارد (Alvar et al., 2012). قدمت بیماری لیشمانیوزیس در ایران به بیش از650 سال پیش از میلاد می­رسد. پور­سینا در کتاب پزشکی مشهور قانون به ضایعاتی پوستی شبیه سالک و به نام خیرونیه (جیرونیه) که مدتی به طول می‌انجامیده و درمانش مشکل و در برابر داروهای گوناگون استقامت می­نموده، اشاره نموده ­است که با نشانه­ها و علائمی که ذکر شده، تصور می­رود منظور زخم سالک بوده است. در ایران به این بیماری سالک اطلاق می­شود که به معنای سال کوچک است. در سال 1390 به 20585 مورد سالک با میزان بروز 27 در 100 هزار نفر ثبت گردیده است. بیش از 90 درصد موارد بیماری در 88 شهرستان کشور اتفاق افتاده است و در 17 استان انتقال بیماری صورت می­گیرد ( احمدنیا و همکاران، 1391).

   عامل لیشمانیازیس جلدی در بیشتر مناطق دنیای قدیم گونه لیشمانیا ماژور است. علائم بالینی به شکل زخمی است که از چند هفته تا چند ماه پس از آلوده شدن شخص سر باز می­کند. سالک یک بیماری خود محدود­شونده است و معمولاً در طی یک سال بهبود می‌یابد. آنچه که درمان سالک را ضروری می‌سازد این است که در 10 درصد موارد،  بیماری سالک به صورت مزمن یا لوپوئید درمی‌آید. در کانون­های شهری، انسان ممکن است مخزن بیماری باشد و با درمان مناسب موارد انسانی، از احتمال انتقال عفونت به افراد سالم کاسته می‌شود (WHO, 2014). زخم سالک اغلب خودبه­خود بهبود می­یابند، ولی به دلائل متعددی از جمله طولانی بودن دوره زخم و احتمال عفونت­های ثانویه ارائه روش درمانی قابل تحمل و بدون عوارض جانبی ضروری به نظر می­رسد (WHO, 2010).

تاکنون اقدامات درمانی مختلفی در درمان سالک به کار رفته است که بطور کلی شامل درمان فیزیکی یا جراحی و درمان دارویی می‌باشد. درمان فیزیکی و جراحی شامل کرایوتراپی، گرمای موضعی، کورتاژ و لیزر آرگون می‌باشد. درمان دارویی شامل درمان سیستمیک و موضعی است. مهمترین داروهای سیستمیک عبارتند ازآنتی موان­های پنج ظرفیتی  (گلوکانتیم و پنتوستام)، کلروکین، پنتامیدین، مترونیدازول، کتوکونازول، داپسون، ایتراکونازول، تربینافین و ریفامپیسین می­باشد که بیشترین طیف درمانی سالک را در بر می­گیرند (WHO, 2014). مهمترین درمانی که امروزه برای انواع لیشمانیازیس به کار می‌رود، ترکیبات 5 ظرفیتی آنتی‌موان هستند که شامل سدیم استیبوگلوکونات (پنتوستام) و مگلومین آنتی موانات (گلوکانتیوم) می‌باشند.

   مواردی از این بیماری نیز وجود دارد که به داروهای مذکور مقاوم بوده و به درمان پاسخ نمی‌دهند. از طرفی به علت وجود عوارض متعدد دارو، تلاش برای دستیابی به داروی جدیدی که بتواند ضمن اینکه زخم را سریع­تر بهبود بخشد، کمترین عوارض جانبی را داشته باشد و پس از بهبودی، جوشگاهی بر جای نگذارد، ادامه دارد (Jaffary et al., 2012; WHO, 2014). بنابراین، مطالعه بر روی گیاهان دارویی جهت یافتن دارویی مناسب علیه انگل لیشمانیا و بیماری لیشمانیازیس از اهمیت بالایی برخوردار است. ترکیبات طبیعی و مواد مشتق از گیاهان به صورت گسترده­ای در مقابله با میکروارگانیسم­های بیماری­زا به کار می­روند (Bisset, 1994). استفاده از گیاهان دارویی در درمان بیماری­های انگلی به دوران باستان بازمی­گردد که مثالی از آن استفاده از پوست درخت گنه گنه به عنوان داروی ضد مالاریا می باشد (Kayser et al., 2002). مطالعه حاضر به منظور ارزیابی تاثیر جوشانده چای سیاه بر پروماستیگوت­های انگل لیشمانیا ماژور در شرایط برون­تنی انجام شد.

 

مواد و روش­ها

کشت انگل لیشمانیا ماژور

   انگل استفاده شده در این مطالعه، لیشمانیا ماژور سویه استاندارد ایران (MRHO/IR/75/ER) می­باشد. ابتدا از زخم فعال موش سفید آزمایشگاهی (نژاد BALB/c) مبتلا به لیشمانیوز جلدی ناشی از لیشمانیا ماژور نمونه برداشته شد و به محیط کشت NNN (Nicolle-Novy–MacNeal) منتقل گردید. لوله­های حاوی محیط کشت به مدت 5 روز انکوبه شدند. به منظور کشت و تولید انبوه پروماستیگوت، انگل­ها درمحیط کشت مایع RPMI1640 پاساژ داده شدند. 

کشتپروماستیگوت­ها با غلظت­های مختلف چای سیاه

   پروماستیگوت­های لیشمانیا ماژور تکثیر و در پلیت‌های کشت سلولی 24 خانه­ای به میزان 3 میلیون انگل در هر میلی­لیتر در محیط تازه پاساژ داده شدند. جوشانده چای سیاه به نسبت­های 10، 20، 30 و 40 درصد حجم نهایی به سوسپانسیون کشت سلولی اضافه گردیده و پلیت­ها به انکوباتور 26 درجه سانتی­گراد انتقال داده شده و در فواصل 5/0، 1، 5، 24، 48 و 72 ساعت پس از مواجهه روند رشد و تکثیر و همین­طور تغییرات موفولوژیک آن­ها با  استفاده از لام نئوبار و میکروسکوپ اینورت (Nikon Ti-E) (از هر غلظت، سه چاهــــک شمـــــــارش شد) ارزیابی گردید. از محیط کشت RPMI حاوی انگل بدون عصاره به عنـــــوان شاهد استفاده شد.

تعیین درصد زنده بودن پروماستیگوت با استفاده از آزمایش MTT

   تعداد 106 ×1 انگل در مرحله لگاریتمی توسط لام نئوبار شمارش و در پلیت کشت 96 خانه در محیط  RPMI 1640 و سرم جنینگاوی 10 درصد کشت داده شد. غلظت­های 10، 20، 30 و 40 درصد از جوشانده چای سیاه به چاهک­ها اضافه شد و برای هر غلظت سه تکرار در نظر گرفته شد.

چاهک­ها در سه زمان 24، 48 و 72 ساعت با روش MTT [3-(4, 5-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]  بررسی شدند. طبق دستورالعمل کیت، پودر MTT با غلظت µg/mL 5 در محلول فسفات بافر (PBS) حل شده و از فیلتر 2/0 عبور داده شد و به هر چاهک Lµ20 افزوده شد و سپس پلیت در دمای 21 درجه سانتی­گراد و شرایط تاریکی به مدت 5-2 ساعت انکوبه شد. رنگ در داخل میتوکندری سلول زنده در اثر آنزیم­های دهیدروژناز تبدیل به کریستال­های نامحلول بنام فورمازان می­شود. پس از گذشت 5-2 ساعت پلیت با دورrpm  2500 به­ مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شده و مایع رویی دور ریخته شد. سپس به هر چاهک µL 100 دی­متیل سولفوکساید (DMSO) به عنوان حل­کننده فورمازان افزوده شد. پس از 10 دقیقه جذب نوری با دستگاه الیزا ریدر در طول موج nm 540 خوانده شد. درصد زنده بودن سلول از طریق فرمول:  (AT-AB)/(AC-AB)×100 محاسبه شد. AB جذب نوری چاهک بلانک، AC جذب نوری چاهک کنترل و AT جذب نوری سلول تیمار شده با عصاره گیاه است.

تحلیل آماری داده­ها

   تحلیل آماری داده­ها با استفاده از روش تحلیل واریانس یک­طرفه (ANOVA) برای مقایسه هر گروه با گروه کنترل انجام شد.

 

یافته­ها

   به مدت 24، 48 و 72 ساعت پس از کشت تعداد پروماستیگوت­های زنده تیمارشده با جوشانده چای سیاه در هــــر چــاهک با استفاده از لام نئوبار و میکروسکوپ شمارش گردید که با افزایش غلظت اسانس گیاه تعداد پروماستیگوت در سه زمان مورد نظر پس از کشت کاهش یافت. کمترین تعداد شمارش­شده انگل مربوط به غلظت 40 درصد بود که در این غلظت 72 ساعت پس از کشت تعداد انگل به 6696 پروماستیگوت در هر میلی­لیتر کاهش یافت (جدول 1). درصد زنده بودن پروماستیگوت­ها با استفاده از آزمایش MTT به­دست آمد که این نتایج نشان داد بیشترین درصد زنده بودن پروماستیگوت­ها مربوط به غلظت 10 درصد از اسانس دارو در 24 ساعت پس از کشت بود (جدول 2).

   بر اساس واکاوی آماری انجام شده تعداد پروماستیگوت­ها در حضور غلظت­های مختلف جوشانده چای سیاه در هر سه زمان شمارش شده در مقایسه با گروه کنترل دارای اختلاف معنا­داری بود(05/0p<). بر اساس نتایج آزمایش MTT درصد زنده بودن تعداد پروماستیگوت­ها در همه غلظت­ها با گروه کنترل اختلاف معنی­داری داشت (05/0p<).

 

 

جدول 1- تعداد پروماستیگوت­های انگل 24، 48 و 72 ساعت پس از اضافه کردن غلظت­های جوشانده چای سیاه

تعداد انگل 72 ساعت پس از کشت

تعداد انگل 48 ساعت پس از کشت

تعداد انگل 24 ساعت پس از کشت

غلظتهای جوشانده چای سیاه

650000

760000

1113333

10%*

3/495333

3/673363

6/986666

20%*

3/173333

3/253343

3/453333

30%*

6696

108000

200400

40%*

1520000

1386667

1240000

کنترل

          *اختلاف بین گروه مورد آزمایش و گروه کنترل معنی دار است (05/0>p)

 

 

جدول 2- درصد زنده بودن پروماستیگوت­های انگل 24، 48 و 72  ساعت پس از اضافه کردن غلظت­های جوشانده چای سیاه

درصد زنده بودن انگل 72 ساعت پس از کشت

درصد زنده بودن انگل 48 ساعت پس  از کشت

درصد زنده بودن انگل 24 ساعت پس از کشت

 

غلظتهای جوشانده چای سیاه

75

82

6/84

10%*

3/69

6/75

3/81

20%*

6/53

3/59

3/63

30%*

6/13

6/24

6/39

40%*

         *اختلاف بین گروه مورد آزمایش و گروه کنترل معنی دار است(05/0>p)

 


بحث و نتیجه­گیری

   در مطالعه حاضر جوشانده چای سیاه میزان تکثیر و مدت زمان بقای انگل را به­طور معنی­داری کاهش داد به­طوری که، با افزایش غلظت جوشانده میزان این تاثیر نیز افزایش یافت. نتایج مطالعه ما با یافته­های سایر مطالعات هم­خوانی دارد. در یک بررسی که روی تاثیر ترکیبات عصاره چای سیاه شامل اسید تانیک، کافئین، تئوفیلین و تئوبرومین بر پروماستیگوت و آماستیگوت‌های لیشمانیا دنوانی، لیشمانیا تروپیکا و لیشمانیا ماژور انجام پذیرفت، نشان داده شد که اسید تانیک بیشترین تاثیر کشندگی روی لیشمانیا را دارد (Mahdi et al., 2005). در تحقیقی دیگری که جهت بررسی تاثیر عصاره الکلی چای سبز بر پروماستیگوت‌های لیشمانیا ماژور انجام پذیرفت، نشان داده شد که این عصاره دارای اثر کشندگی بسیار خوبی بر فرم تاژک­دار انگل بوده و قادر به ممانعت از رشد آن­ می­باشد (Feily et al., 2012).

   سن و همکاران در سال 2007 اثر ضد لیشمانیایی گیاه آرتمیسنین ترایگرس را بر پروماستیگوت­های لیشمانیا دونووانی بررسی کردند و مشاهده نمودند که گیاه آرتمیسنین دارای اثر ضد لیشمانیایی بر  پروماستیگوت­ها و آماستیگوت­های انگل می باشد (Sen et al., 2007). در مطالعه دیگری یوسفی و همکاران در سال 2009 تـــــاثیر کشندگی گیــاهان پکانوم هارمالا و آلکانا تینکتورا را بر لیشمانیا ماژور در شرایط برون­تنی انجام دادند و دریافتند که هر دو عصاره دارای اثر مهاری بر پروماستیگوت­ها بودند (Yousefi et al., 2009).

   چای سیاه حاوی پلی­فنل­هایی مانند فلاوین و تیرابیجین می­باشد (Łuczaj and Skrzydlewska, 2005). بیشترین خواص سلامت­بخشی چای به فعالیت قوی آنتی­اکسیدانی ترکیبات فنلیک چای که تحت عنوان کاتچین­ها شناخته شده­اند، نسبت داده می­شود (Zaveri, 2006; Fujiki et al., 2005). کاتچین­ها دارای ویژگی‌های­آنتی­اکسیدانی قوی بوده و این ترکیبات ممکن است از بدن در مقابل آسیب ناشی از رادیکال‌های آزاد محافظت نمایند. علاوه بر این، بسیاری از مطالعات نشان­دهنده فعالیت ضد میکروبی انواع مختلف عصاره­های چای روی انواع مختلف میکروارگانیسم­های بیماری­زا بوده است (Almajano et al., 2008; Manian et al., 2008).

  پلی­فنل­ها یکی از مهم­ترین ترکیبات موجود در برگ‌های چای بوده و گفته شده است که پلی­فنل­های گیاهی یا تانن­ها  از طریق اتواکسیداسیون و تولید پراکسیدهیدروژن، اثر مهاری خود را روی رشد یاخته، از جمله یاخته­های میکروبی اعمال می­کنند (Nakahara et al., 1993). برگ­های سبز و تازه چای غنی از فلاونول­های مونومریک می­با­شند که در این میان کاتچین­ها و اپی­گالوکاتچین­گالات­ها به­عنوان فراوان­ترین کاتچین­های چای سبز شناخته شده­اند. تفاوت در انواع چای به دلیل تفاوت در فرآوری آنها می­باشد . چای سبز از برگ­های تخمیر نیافته، چای اوولانگ از برگ‌هایی که تخمیر نسبی (نیمه تخمیری) داشته­اند و چای سیاه از برگ­های تخمیر یافته به­دست می­آید. برگ­های تخمیر شده حاوی پلی­فنل­های کمتر و کافئین بیشتری می­باشند و به همین دلیل چای سبز دارای بالاترین محتوای پلی­فنلی بوده و محتوای کافئین در چای سیاه دو تا سه برابر چای سبز می­باشد (Sasaki et al., 2003).

   یکی از مکانیزیم­های فعالیت آنتی­اکسیدانی که مهم‌ترین فعالیت کاتچین­های چای نیز می­باشد، از بین بردن رادیکال­های آزاد و در نتیجه مهار فرایند اکسیداسیون می­باشد. همچنین، این مکانیزیم توجیهی برای فعالیت ضدمیکروبی کاتچین­ها در سلول­ها و غشاهای سلولی به شمار می­آید (Almajano et al., 2008).

   در بررسی تاثیر یک فرآورده دارویی بایستی عوامل بسیاری از جمله موثر بودن دارو بر مرحله عفونت­زای ارگانیسم را مد نظر قرار داد که در مورد انگل لیشمانیا فرم عفونت­زای انگل، اشکال بدون تاژک داخل سلولی یعنی آماستیگوت می­باشد. بنابراین، یکی از مهم­ترین ایرادات این مطالعه و بسیاری از بررسی­های صورت گرفته، ارزیابی تاثیر دارو بر پروماستیگوت­های انگل که فرم موجود در بدن پشه است، می باشد که علت آن نیز سهولت برقراری کشت این مرحله از انگل در شرایط برون­تنی است. در هر صورت، مطالعه حاضر نشان داد که جوشانده چای سیاه به خوبی قادر به مهار الگوی طبیعی رشد پروماستیگوت­های انگل لیشمانیا بوده و با مکانیسمی نامشخص روند تکثیری آن را مختل می­کند. بررسی شاخصه­های مورفولوژیکی انگل­ها نشان­دهنده توانایی آلکالوئید­های موثره گیاه در تخریب ارگانیسم­ها و بیانگر دارا بودن عوامل غیرفعال­کننده ساختار انگل می­باشد.

   در مجموع می­توان بیان نمود که جوشانده چای سیاه که فرم فرآوری شده چای بوده و در عین حال ساده‌ترین حالت تهیه عصاره گیاه می­باشد، تاثیر بسیار مناسبی بر فرم تاژکدار انگل داشته و با توجه به این تاثیر پیشنهاد می­شود که بخش­های مختلف این گیاه تفکیک گردیده و ترکیبات فعال آن شناسایی شده و مطالعات گسترده­تری جهت ارزیابی تاثیر این آلکالوئیدها بر فرم عفونت­زای انگل در شرایط درون تنی و برون تنی انجام پذیرد.

  • · احمدنیا، ه.، قطبی، م. و رحیمی، ف. (1391). راهنمایجامعنظاممراقبت بیماری‌های واگیر برای پزشک خانواده.، اندیشمند.
  • · جعفری، ف.، نیلفروش زاده، م.ع.، توکلی، ن.، ذوالفقاری، ب. و شهبازی، ف. (1391). اثر ژل موضعی بومادران همراه با تزریق داخل ضایعه‌ گلوکانتیم در درمان لیشمانیوز جلدی حاد نوع روستایی.  مجله دانشکده پزشکی اصفهان، دوره 29 ،شماره 173.
    •  Almajanoa, M.P., Carbóa, R., López Jiménezb, J.A. and Gordon, M.H. (2008). Antioxidant and antimicrobial activities of tea infusions. Food Chemistry, 108(1): 55-63.
    • Alvar, J., D.Ve´lez, I., Bern, C., Herrero, M., Desjeux, P., Cano, J., et al. (2012). Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. Plos One, 7(5): p.e35671.
    • Bisset, N.J. (1994). Herbal drugs and phytopharmaceuticals. London and Tokyo: Medpharm, Stuttgart and CRC, Bota Raton, Ann Arbor, pp: 566.
    • Castelli, G., Galante, A., Lo Verde, V., Migliazzo, A., Reale, S., Lupo, T., et al. (2014). Evaluation of Two Modified Culture Media for Leishmania infantum Cultivation Versus Different Culture Media. The Journal of parasitology, 100(2): 228-230.
    • Cox, F.E.G. (2002). History of human parasitology. Clinical microbiology reviews, 15(4): 595-612.
    • Feily, A., Saki, J., Maraghi, S., Moosavi, Z., Khademvatan, S. and Siahpoosh, A. (2012). In vitro activity of green tea extract against Leishmania major promastigotes. International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 50(3): 233-236.
    • Fujiki, H., Suganuma, M., Matsuyama, S. and Miyazaki, K. (2005). Cancer prevention with green tea polyphenols for the general population, and for patients following cancer treatment. Current Cancer Therapy Reviews, 1(1): 109-114.
    • Kayser, O., Kiderlen, A.F. and Croft, S.L. (2002). Natural products as potential antiparasitic drugs. Studies in Natural Products Chemistry, 26: 779-848.
    • Łuczaj, W. and Skrzydlewska, E. (2005). Antioxidative properties of black tea. Preventive Medicine, 40(6): 910-918.
    • Mahdi, H., Al-Bashir, N., Saour, K. and Mahdi, L. (2005). In vitro antileishmanial effects of black tea extract components. Jordan Journal of Applied Science, 7(2): 38-50.
    • Manian, R., Anusuya, N., Siddhuraju, P. and Manian, S. (2008). The antioxidant activity and free radical scavenging potential of two different solvent extracts of Camellia sinensis (L.) O. Kuntz, Ficus bengalensis L. and Ficus racemosa L. Food Chemistry, 107(3): 1000-1007.
    • Nakahara, K., Kawabata, S., Ono, H., Ogura, K., Tanaka, T., Ooshima, T., et al. (1993). Inhibitory effect of oolong tea polyphenols on glycosyltransferases of mutans Streptococci. Applied and Environmental Microbiology, 59(4): 968-973.
    • Nasiri, V., Karimi, G., Dalimi, A., Paykari, H. and Ghaffarifar, F. (2013). Effects of sheep and mouse urine on the growth pattern of leishmania major promastigotes. BioMed Research International, Article ID 748592,doi:10.1155/2013/748592.
    • Sasaki, H., Matsumoto, M., Tanaka, T., Maeda, M., Nakai, M., Hamada, S., et al. (2004). Antibacterial activity of polyphenol components in oolong tea extract against Streptococcus mutans. Caries Research, 38(1): 2-8.
    • Sen, R., Bandyopadhyay, S., Dutta, A., Mandal, G., Ganguly, S., Saha, P., et al. (2007). Artemisinin triggers induction of cell-cycle arrest and apoptosis in Leishmania donovani promastigotes. Journal of Medical Microbiology, 56(9): 1213-1218.
    • World Health Organization (2010). Control of the leishmaniases. World Health Organ Technical Report Series, 949: 186.
    • World Health Organization (2014). Manual for case management of cutaneous leishmaniasis in the WHO Eastern Mediterranean Region, Available at: http://apps.who.int//iris/handle/10665/120002.
    • Yousefi, R., Ghaffarifar, F. and Dalimi Asl, A.D. (2009). The Effect of Alkanna tincturia and Peganum harmala Extracts on Leishmania major (MRHO/IR/75/ER) in vitro. Iranian Journal of Parasitology, 4(1): 40-47.
    • Zaveri, N.T. (2006). Green tea and its polyphenolic catechins: medicinal uses in cancer and noncancer applications. Life Sciences, 78: 2073-2080.